Những vật liệu
khác nhau sẽ được coi như những cơ chất khác nhau
để phân lập nấm. Vật liệu chung nhất thường là: lá
cây tươi, lá cây rụng, lá cây mục, phân động vật,
côn trùng, nước ngọt, nước biển,....
Trước khi đi lấy
mẫu phân lập nấm sợi chúng ta phải cân nhắc và suy
nghĩ về những điều cần thiết sau:
1, Sẽ chọn loại
vật liệu để phân lập cho loại nấm nào.
2, Dùng bản đồ
kiểm tra lại vị trí lấy mẫu.
3, Sẽ dùng phương
pháp phân lập nào cho mẫu đó.
4, Và cuối cùng
là sẽ mang mẫu như thế nào về phòng thí nghiệm.
Sau đó sẽ
quyết định nơi lấy mẫu, chuẩn bị cho chuyến đi lấy
mẫu đó, mang theo những dụng cụ cần thiết như: Túi
ni lông, thìa cân, túi đựng mẫu làm bằng giấy,
chai lọ, đèn gas xách tay, túi chứa, ... Khi tới nơi
lấy mẫu chúng ta quyết định số lượng mẫu sẽ lấy.
Một điều
cũng rất quan trọng là phân lập nấm sau khi lấy mẫu
càng sớm càng tốt.
I. Mẫu đất.
Mẫu đất là mẫu có hiệu quả nhất và
chúng ta có thể phân lập nấm trên mẫu đất với số
lượng lớn. Chúng ta có thể lấy mẫu đất ở nhiều nơi
chẳng hạn như ở ruộng lúa, nơi trồng cây lấy hạt
hoặc cánh đồng trồng rau, dưới rừng tùng hay dưới
rừng tán lá rộng, ở vùng núi cao, ven bừ suối,...
Thông thường nấm phân lập được từ mẫu đất gọi là nấm
đất, nhưng một số nấm phân lập được ở đáy hồ ao,
sông suối hay đáy biển lại gọi là nấm ưa nước hay
nấm ưa mặn.
Để phân lập được nhiều loài nấm khác
nhau, chúng ta nên lấy mẫu đất trên bề mặt dưới lớp
lá cây mục bởi vì quần thể nấm tập trung trên lớp
đất bề mặt nhiều hơn là phần dưới đất sâu. Khi lấy
mẫu ta gạt bỏ lớp lá mục để lộ bề mặt lớp đất và
dùng thìa sạch lấy phần đất bề mặt đó cho vào túi ni
lông. Đồng thời ghi các thông số cần thiết về nơi
lấy mẫu: địa chỉ, kinh độ, vĩ độ, ngày lấy mẫu, tình
trạng lấy mẫu, nhiệt độ lúc lấy mẫu, người lấy mẫu.
II. Lá và cành
cây khô:
Nấm Sợi phân lập
từ lá và cành cây khô gọi là nấm rác (litter fungi).
Để phân lập nấm rác có hiệu quả chúng ta phải lấy
mẫu lá và cành cây tốt, trong trường hợp nấm rác,
chúng ta phân lập được các loài nấm khác nhau khi
lấy mẫu ở độ sâu khác nhau trong cùng một mẫu.
Mẫu lá cây khô lấy được nên để trong
túi bằng giấy và nên xử lý ngay để phân lập, vì nếu
để lâu theo thời gian mẫu khô dần, nấm rác trong mẫu
sẽ phát triển kém đi và các vi sinh vật bên ngoài sẽ
xâm nhiễm vào.
Vì thế phải ghi
rõ tên thực vật lấy mẫu, độ phân huỷ của lá cây
rụng, nơi lấy mẫu (kinh dộ, vĩ độ, địa chỉ), ngày
tháng lấy mẫu, người lấy mẫu.
III. Lá tươi và
vỏ cây:
Có ít nhất
3 nhóm nấm phân lập từ lá cây tươi, nhóm thứ nhât là
nấm bề mặt lá (phyloplane fungi). Nhóm thứ 2 thuộc
về nấm gây bệnh, bao gồm ký sinh bắt buộc và không
bắt buộc. Nhóm thứ 3 là nấm thực vật hoại sinh,
nhưng sự khác nhau giữa nhóm thứ 3 này và nhóm kí
sinh không bắt buộc không phải lúc nào cũng rõ ràng.
Trong khi lấy mẫu lá cây tươi và vỏ
cây, luôn phải ghi nhớ 6 điều sau:
1, Quá trình phân
huỷ có thể đã diễn ra, mặc dù trông bề ngoài lá vẫn
như đang còn tươi (đặc biệt điều này hay diễn ra ở
vùng nhiệt đới).
2, Hệ sinh thái
nấm trên lá thực vật sau khi ngắt có thể khác đi so
với khi chúng còn trên cây.
3, Tính đa dạng
sinh học của nấm ở lá tươi còn non sẽ kém hơn ở lá
đã trưởng thành.
4, Hệ sinh thái
nấm có thể khác nhau giữa bề mặt lá và mặt sau của
lá.
5, Trong cùng một
cây độ cao lấy mẫu của chúng sẽ cho hệ sinh thái nấm
khác nhau.
6, Mỗi loài thực
vật khác nhau sẽ phân lập được các chủng nấm đặc
hiệu, ví dụ như loài nấm Trochophora simplex
chỉ phân lập được từ cây Daphniphyllum
macropodium.
Đặc biệt khi phân lập nấm từ mẫu lá và
vỏ cây thực vật chúng ta rất khó có thể phân lập
được loài nấm trong thực vật gọi là nấm nước trên
cạn (terrestrial aquatic fungi). Bởi vì nhóm nấm này
sinh trưởng rất chậm và không dễ dàng sinh bào tử
như những nấm trên bề mặt, nấm gây bệnh hay cácnấm
hoại sinh khác. Vì thế khó có thể phân lập các loài
nấm này từ lá cây hay từ vỏ cây nếu chỉ sử dụng
những kỹ thuật phân lập thông thường.
Nấm nước trên cạn sinh bào tử nhanh
chóng nếu có nước kích thích, chẳng hạn gặp mưa,
sương. Chúng ta lấy mẫu sau khi trời mưa hoặc lấy
mẫu từ những giọt sương đọng trên cành lá.
IV. Phân.
Thành phần hữu cơ trong phân là rất
lớn, do đó khu hệ vi sinh vật trong đó vô cùng đa
dạng. Những loài nấm có thể tồn tại được trên phân
động vật được gọi là nấm phân. Sự thay đổi của nấm
phân xuất hiện trên một mẫu phân động vật là một ví
dụ điển hình về tính kế thừa ở nấm. Xuất hiện đầu
tiên là ngành nấm tiếp hợp Zygomycota (ví dụ
Basidiobolus), tiếp đến là Pyrenomycetes,
Plectomycetes, và Discomycetes của ngành
nấm túi Ascomycota (ví dụ Arthroderma, Gymnoascus,...)
rồi đến các nấm hoại sinh (Ví dụ Arthrobotrys,
Oedocephalum, Scopulariopsis,...) và cuối cùng
là nấm đảm Basidiomycota (ví dụ Corprinus)
[5].
Người ta thường phân lập nấm phân từ
phân động vật ăn cỏ chẳng hạn như phân ngựa, cừu,
dê, thỏ, gia súc, và thậm chí là chuột cũng đã được
công bố. [5]
V. Côn trùng.
Những côn
trùng nhỏ bé, chẳng hạn như amip, giun đất, ve rận,
sâu bọ,.... là những mẫu tốt dùng cho phân lập nấm.
Đặc biệt là nấm hoại sinh giun tròn
(nematode-trapping fungi).
VI. Nước ngọt và
các vật liệu có trong nước ngọt.
Từ mẫu nước ngọt chủ yếu phân lập được
2 nhóm nấm: nhóm thứ nhất là Chytridiomycota, nhóm
thứ 2 là các loài nấm ưa nước, ưa nước hiếu khí. Để
phân lập nhóm nấm này, nên lấy mẫu nước ngọt và lá
rơi ở những ổ sinh thái nước, chẳng hạn như ở sông,
suối, ao hồ. Đặc biệt nấm ưa nước dễ dàng bị mắc vào
những khúc gỗ mục dưới lòng suối hay đằng sau các
hốc đá có dòng nước chảy tạo bọt.
VII. Nước mặn và
các vật liệu có trong nước mặn.
Nấm sợi sống ở nước mặn gọi là nấm sợi
ưa mặn, những đặc điểm hình thái và sinh lý của
chúng giúp chúng thích nghi được với môi trường mặn.
Có 2 nhóm nấm ưa mặn: một loại là ưa mặn bắt buộc
(toàn bộ vòng đời của chúng trải qua trong môi
trường mặn); loại kia là ưa mặn không bắt buộc (phần
lớn có thể phân lập được chúng trong môi trường đất
và cả trong môi trường mặn).
Để phân lập nấm ưa mặn, ta có thể lấy
mẫu từ các cành củi mục, thực vật ưa mặn, thực vật
ven biển, từ cát ở bãi biển và từ nước biển, đặc
biệt là bọt biển là mẫu rất tốt để phân lập nấm ưa
mặn.
Tóm lại:
Để lấy mẫu phân lập nấm thì bất kỳ loại mẫu nào cũng
đều tốt, đều quan trọng, điều chủ yếu vẫn dựa vào
mục đích phân lập nhóm nấm nào cần thiết cho công
tác nghiên cứu để sự lựa chọn mẫu và phương pháp lấy
mẫu.
Trên cùng một cơ chất, có thể có nhiều
nhóm nấm tồn tại mỗi nhóm lại có một chu kỳ sống
khác nhau, nên phân lập ở nhiều thời điểm khác nhau
và bằng các phương pháp khác nhau thì có thể phân
lập được loài mới hay tìm ra một hệ sinh thái mới
của nấm.
PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP:
Kỹ thuật phân lập để tìm ra loài nấm
mới hay nấm hữu ích là rất quan trọng trong quá
trình nghiên cứu. Không có một quy luật chung nào
dùng cho phân lập vi sinh vật. Phương pháp phân lập
tốt nhất sẽ là phương pháp mà ta lựa chọn để phân
lập vi sinh vật mà ta cần. Suy nghĩ một cách sáng
tạo cho công việc và thành thạo với các kỹ thuật
phân lập mới là yêu cầu chung của bất kỳ một nhà vi
sinh vật nào.
Các nhà nấm học Nhật Bản thường dùng
các phương pháp sau để phân lập nấm sợi: Sử dụng kim
nhọn nhặt bào tử (Dr. Chiharu Nakashima); Phân lập
bào tử đơn độc (Dr. Chiharu Nakashima); Sử dụng vi
thao tác Skerman (Dr. Katsuhiko Ando); Phương pháp
pha loãng (Dr. Misa Otoguro); Phân lập từ bào tử
đảm (Dr. Chiharu Nakashima); Phương pháp rửa bề mặt
(Dr. Katsuhiko Ando); Phương pháp sát khuẩn bề mặt
(Dr. Ju-Young Park); Phương pháp dùng buồng kích ẩm
(Dr. Katsuhiko Ando); Phương pháp kích thích sự nảy
mầm của nấm(Dr. Ju-Young Park); Phương pháp sục khí
(Dr. Katsuhiko Ando). Dưới đây chúng tôi xin phép
trình bày một số phương pháp hay dùng nhất, đã áp
dụng phân lập nấm trong đất, trong lá cây rụng và
nấm nội sinh endophyte tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi
sinh vật- Trung tâm công nghệ Sinh học- Đại học Quốc
gia Hà nội trong chương trình hợp tác về nghiên cứu
đa dạng sinh học với Viện Công nghệ và Đo lường Quốc
gia Nhật Bản (NITE- Japan).
1. Phương pháp
dùng kim nhọn:
Sử dụng phương
pháp này để phân lập tất cả mọi loại nấm phát triển
trên bất kỳ một cơ chất nào.
Cách làm:
1) Đặt cơ chất
cần phân lập (lá, cành cây mục,...) lên kính hiển
vi vật kính X10 (độ phóng đại 10 lần) hoặc lên kính
lúp.
2) Chỉnh tiêu cự
để quan sát được bào tử, cuống sinh bào tử từ cơ
chất.
3) Khử trùng que
nhọn bằng ngọn lửa đèn cồn.
4) Đưa que nhọn
vào khoảng giữa vật kính và cơ chất, nhặt bào tử
chuyển sang môi trường phân lập.
5) Nuôi cấy bào
tử ở nhiệt độ 250C, quan sát sự nảy mầm
của bào tử hàng ngày đến khi hình thành khuẩn lạc
thì chuyển sang môi trường thạch nghiêng.
2. Phương pháp
phân lập bào tử đơn độc:
Sử
dụng phương pháp này để phân lập nấm gây bệnh thực
vật.
Cách làm:
1) Chuẩn bị dịch
huyền phù bào tử:
Dùng kim nhọn
đánh bẹt 1 đầu, gắn vào một cái tay cầm chắc chắn,
dùng que đó cào vào chỗ trên lá cây bệnh có xuất
hiện đốm nấm, đặt sang lam kính đã có sẵn một giọt
nước vô trùng, khuấy đềù.
2) Dùng đầu kim
lấy một giọt nước có hoà tan bào tử đó vẽ một hình
tam giác lên môi trường thạch nước (Water agar). Ủ
200C trong 24 giờ.
3) Quan sát bằng
kính hiển vi, tìm bào tử nảy mầm trên môi trường
thạch đĩa theo đường viền tam giác trên. Đánh dấu
điểm có bào tử nẩy mầm bằng bút viết kính ở mặt dưới
đĩa thạch.
4) Chuyển đĩa môi
trường thạch có nuôi cấy các bào tử trên sang kính
lúp. Quan sát vị trí đánh dấu bào tử nẩy mầm. Thanh
trùng que cấy, dùng que cấy lấy bào tử nảy mầm ra,
chuyển sang ống nghiệm môi trường thạch nghiêng để
nuôi cấy.
3. Phương pháp
dùng vi thao tác Skerman:
Chuẩn bị dụng cụ:
Bộ vi thao tác
Skerma gồm 5 phần (hình bên).

1) Lấy một ống
pipet pastơ hơ trên ngọn lửa đèn cồn, kéo thành ống
rất nhỏ, dài khoảng 4cm, gắn vào ống sắt trên cục
nam châm D ( cố định bằng parafin nóng chảy).
2) Cố định phần
dụng cụ B vào vật kính 10
3) Gắn nam châm
có ống thuỷ tinh vào rãnh kim loại của dụng cụ B.
4) Di chuyển phần thiết bị có gắn cục nam châm lên
xuống cho đến khi nhìn thấy đầu ống thuỷ tinh ở giữa
vi trường.
5) Gắn đầu kim
hàn E vào biến thế A và đặt vào vị trí đặt tiêu bản
của kính hiển vi.
6) Chỉnh kính,
tìm vi trường, quan sát đầu kim hàn, điều chỉnh sao
cho đầu que hàn và ống thuỷ tinh sát nhau và đều
quan sát được dưới kính hiển vi.
7) Bật biến
thế A nấc cao để đầu que hàn nóng đỏ và tiến về phía
ống thuỷ tinh, ấn que hàn chạm vào ống thuỷ tinh để
ống thuỷ tinh bắt đầu nóng chảy, kéo nhanh ống thuỷ
tinh khỏi kim hàn tạo thành que thuỷ tinh thuôn
nhọn.
8) Hạ nhiệt độ
que hàn bằng cách giảm biến thế, dùng đầu que hàn
chạm nhẹ vào đầu que thuỷ tinh kéo nhẹ tạo thành
hình chữ L.
Giờ đây ta có thể
bắt đầu thực hành lấy từng bào tử đơn độc trên đĩa
thạch.
Các bước tiến
hành:
1) Chuẩn bị mẫu:
lá cây khô, cho vào hộp nhựa hoặc túi ni lông có
chứa nước vô trùng sẵn để làm ẩm, giữ 2-3 ngày ở
nhiệt độ phòng, để kích thích bào tử nẩy mầm.
2) Lấy mẫu lá
trên cho vào cốc thuỷ tinh, cho thêm nước cất, khuấy
nhẹ nhàng cho bào tử nổi lên mặt nước.
3) Thu thập bào
tử bằng cách lấy lam kính để nghiêng 450
so với mặt nước để lấy nước trên bề mặt cốc. Dùng
lam kính đó trải một đường thẳng trên mặt đĩa môi
trường phân lập nấm LCA (Low cacbon agar), MEA
(Malt extract agar).
4) Quan sát đĩa
thạch trên dưới kính hiển vi, tìm bào tử có hình
dạng đặc biệt. Khi thấy bào tử cần tìm thì giữ
nguyên vị trí.
5) Gắn phần dụng
cụ hình chữ V (hình C) của bộ vi thao tác vào vật
kính 10 của kính hiển vi. Tiếp đến gắn phần nam châm
có que thuỷ tinh hình chữ L vừa làm xong vào phần
dụng cụ chữ V đó.
Điều chỉnh lên
xuống sao cho có thể quan sát được đầu chữ L của que
thuỷ tinh.
6) Nâng kính lên
sao cho bề mặt thạch sát với đầu que thuỷ tinh, lúc
này ta có thể quan sát được cả bào tử nấm cần tìm và
cả đầu L của que thuỷ tinh.
7) Dùng que L kéo
bào tử cần lấy ra phần môi trường sạch của đĩa
thạch. Dùng chính kim phần chữ L đó đánh dấu điểm
đặt bào tử.
8) Hạ đĩa môi
trường thấp xuống và dùng que cấy vô trùng lấy bào
tử tại điểm đánh dấu chuyển sang đĩa thạch môi
trường MEA. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và quan sát sự
nảy mầm của bào tử hàng ngày. Nếu bào tử nảy mầm thì
có thể chuyển sang thạch nghiêng để giữ giống sau
khi để ở thạch đĩa 2-4 tuần.
4. Phương pháp
pha loãng:
Phương pháp này
dùng cho các mẫu đất.
1. Trước hết các
mẫu đất phải được xử lý trước khi phân lập bằng cách
phơi khô ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày, sau đó dùng rây
qua sàng có kích thước 2-3mm.
2. Cân 1g đất đã
xử lý cho vào 9ml nước cất khử trùng, dùng vortex
hoà tan đất.
3. Pha loãng mẫu
ở các nồng độ pha loãng khác nhau: 10-4,
10-5 là 2 nồng độ thích hợp để phân lập
nấm trong đất ở Việt Nam.
4. Hút 0,5 ml
dịch pha loãng ở 2 nồng độ trên nhỏ lên đĩa Peptri
chứa môi trường phân lập ( môi trường Martin, hoặc
môi trường cơ sở). Dùng que gạt trang đều dịch trên
bề mặt thạch.
5. Đặt đĩa thạch
trong tủ 250C, phân lập nấm sợi từ những
khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa thạch sau khoảng thời
gian 4- 10 ngày.
5. Phương pháp
pha loãng kết hợp với xử lý tia cực tím:
Tương tự
như 4 bước ban đầu của phương pháp pha loãng. Thêm
một bước tiếp đó là đặt đĩa Peptri chứa môi trường
phân lập và đã gạt dịch pha loãng đều trên bề mặt
thạch vào tủ cấy và bật đèn tím 20 phút.
Các bước khác
tương tự như phương pháp pha loãng thông thường.
6. Phương pháp
phân lập nấm đảm và nấm túi (Basidiomycetes và
Ascomycetes)
1. Quả thể
nấm sau khi thu hái, rửa sạch, cắt miếng nhỏ khoảng
5cm phần bên trong.
2. Rửa
sạch bằng nước cất vô trùng (2-3 phút), sau đó dùng
băng dính 2 mặt dính 3-4 miếng cắt quả thể gắn vào
nắp trên của đĩa thạch nước. Đánh dấu vị trí gắn
miếng nấm bằng bút viết kính ở đáy đĩa thạch nước.
3. Ủ 200C
trong vòng 24 giờ.
4. Soi
dưới kính lúp tại vị trí đánh dấu xem độ nảy mầm của
bào tử nấm.
5. Dùng
que cấy hình vòng tròn lấy đám bào tử vừa nảy mầm đó
chuyển sang đĩa môi trường thạch cao malt.
7. Phương pháp
rửa bề mặt:
Phương pháp này
dùng để phân lập nấm từ lá tươi hoặc lá rụng.
Cách làm:
1) Cắt mẫu
lá cây (tươi và khô), rễ cây, cành cây,... ra thành
các miếng nhỏ, sau đó cho vào ống nghiệm.
2)Thêm
20ml dung dịch 0.005% Aerosol OT (di-iso-octyl
sodium sulfosuccinate) hoặc dung dịch 0.005% Tween
80, lắc mạnh bằng máy vortex khoảng 10 phút để loại
trừ vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu.
3) Bước
làm khô mẫu: loại bỏ nước trong ống nghiệm, dùng kẹp
vô trùng lấy mẫu ra đặt lên bề mặt giấy lọc để qua
đêm trong tủ cấy vô trùng, bước này có tác dụng loại
bỏ sự nhiễm khuẩn.
4) Dùng
kẹp vô trùng đặt mẫu đã làm khô lên bề mặt môi
trường thạch LCA lăn một vòng mẫu lá (để loại tạp
nhiễm (nếu có) một lần nữa), mỗi đĩa thạch có thể
chia làm 8 phần để kiểm tra.
5) Sau đó
chuyển mẫu sang đĩa thạch môi trường LCA vô trùng
khác, mỗi đĩa nên đặt một mẫu, mỗi mẫu 5 miếng cắt.
Ủ ở nhiệt độ 250C trong vòng một tháng.
6) Trong
khoảng thời gian đó hàng ngày phải kiểm tra sự nảy
mầm của các vi sinh vật dưới kính lúp, phân lập nấm
sợi nếu có.
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LOẠI NẤM SỢI
I Yêu cầu:
- Có được
các chủng nấm sợi thật thuần khiết (không được lẫn
tạp nấm hoặc các vi sinh vật khác).
- Các
chủng cần định loại phải được nuôi cấy trên các môi
trường, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy theo đúng quy
định của các khoá phân loại đối vối từng chi nấm
mốc.
II. Quy trình
định loại một chủng nấm sợi:
1. Quan sát
đặc điểm phân loại của chủng nấm sợi cần định loại.
1.1. Quan sát đặc
điểm khuẩn lạc trên thạch
- Hình
dáng
- Kích
thước (đường kính, chiều dày)
- Dạng mặt
(nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có
khía hay không…)
- Màu sắc
khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới
- Dạng mép
khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo…)
- Giọt
tiết nếu có (nhiều, ít, màu sắc)
- Mùi
khuẩn lạc (có, không mùi)
- Sắc tố
hoà tan (màu của môi trường xung quanh khuẩn lạc)
nếu có.
- Các cấu
trúc khác: bó sợi, bó giá (Synnematous or
sporodochial conidiomata) các cấu trúc mang bào tử
trần (Fruit body - conidiomata) như đĩa giá
(acervuli) hoặc túi giá (Pycnidia), đệm nấm
(Stroma), hạch nấm (sclerotia) vv..
1.2. Quan sát các
đặc điểm vi học
- Sợi nấm:
(hyphae) có vách ngăn, không có vách ngăn, có mấu.
- Bào tử
trần(conidia): kiểu phát sinh bào tử trần (ở nấm bất
toàn), hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt (nhẵn,
có gai, gồ ghề) cách sắp xếp đơn độc chuỗi gốc non
(basipetal) chuỗi gốc già (acropetal) khối cầu vv…
- Bộ máy
mang bào tử (spore apparatus): nang bào tử và nang
bào tử nhỏ (nếu có) (Sporangia & Sporangiola) hình
dáng, kích thước, màu sắc, bề mặt của nang, cuống
nang, không hoặc có nhánh (nhánh mọc vòng, mọc cách,
hợp trục vv…); bào tử nang ( hình dạng, kích thước,
bề mặt, …) ở nấm tiếp hợp.
- Bộ máy
mang bào tử trần (conidiogenous apparatus): giá bào
tử trần (conidiophore) - kích thước, đường kính,
chiều dài, bề mặt (nhẵn, có gai, có nốt sần, vv…)
màu sắc, có vách ngang hoặc không, có hoặc không có
cấu trúc đặc biệt như tế bào chân (foot cell) sợi
cứng (setae) tăng trưởng ở gốc hoặc ở ngọn có hoặc
không có dạng hình thái đặc biệt như bó giá, đệm
giá. Các nhánh (của bào tử trần) số lượng nhánh,
kích thước bề mặt, màu sắc, cách sắp xếp (đối xứng,
không đối xứng sát nhau hoặc tẽ rộng, vị trí dọc giá
bào tử trần hoặc tập trung ở ngọn giá)vv…
- Tế bào
sinh bào tử trần (conidiogenous cell)
Kiểu tế bào sinh
bào tử trần (thể bình, dạng có khuyên ở đỉnh, dạng
sinh bào tử trần đồng thời, như dạng (dạng bình-
phialo type; dạng phân đốt, Annello type). Dạng sinh
bào tử trần không đồng thời (Aleurio- type), bào tử
đính kiểu nảy chồi (Blasto - type), dạng sinh bào tử
trần qua lỗ để lại sẹo (Poro - type) vv.. hình dạng,
kích thước, màu sắc, cách sắp xếp (đơn dộc hoặc
thành cụm, thành vòng), vị trí (trên sợi nấm, dọc
theo giá bào tử trần, các nhánh hoặc ở đính giá) vv…
- Thể quả
túi (ascocarp) như cleistothecium, cần khảo sát vị
trí, số lượng, hình dạng, kích thước, màu sắc, bề
mặt của thể quả, quan sát túi bào tử (ascus) bào tử
túi (ascospore) về hình dạng, kích thước bề mặt.
III. Tiến hành
định loại
Căn cứ vào kết
quả quan sát đầy đủ, chính xác các đặc điểm của
khuẩn lạc và các đặc điểm vi học tiến hành xác định
tên loài (hoặc thứ nếu có) chủng nấm mốc như sau:
- Dùng
khoá phân loại của các nhóm phân loại bậc cao
(ngành, ngành phụ, lớp, bộ, họ, chi) để xác định lần
lượt xem những nấm mốc thuộc chi nấm mốc nào. Tiếp
theo dùng khoá phân loại của chi đó để xác định đến
loài (thứ) bằng cách so sánh tất cả các đặc điểm đã
quan sát được của chủng nấm mốc đó với các đặc điểm
tương ứng của loài nào đó trong khoá phân loại. Nếu
các đặc điểm so sánh phù hợp với đặc điểm của loài
mô tả trong khoá, ta xác định được tên loài của
chủng nấm mốc cần định loại.
- Nếu có
chủng nấm mẫu của loài (hoặc thứ) vừa xác định thì
tiến hành so sánh các đặc điểm hình thái khuẩn lạc,
đặc điểm vi học của chủng mẫu với các đặc điểm tương
ứng của chủng cần định loại. Nếu các đặc điểm của 2
chủng phù hợp với nhau thì có thể khẳng định chắc
chắn loài (hoặc thứ) của chủng nấm mốc cần định
loại.
- Nếu có chủng
nấm mẫu của loài (hoặc thứ) vừa xác định thì tiến
hành so sánh các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc
điểm vi học của chủng mẫu với các đặc điểm tương ứng
của chủng cần định loại. Nếu các đặc điểm của 2
chủng phù hợp với nhau thì có thể khẳng định chắc
chắn loài (hoặc thứ) của chủng nấm mốc cần định
loại.
KHOÁ PHÂN LOẠI ĐẾN LỚP(
Robert A. samson, 1984)
1a. Khuẩn lạc gồm
các tế bào nảy chồi, không có hệ sợi NẤM MEN (
YEAST)
1b. Khuẩn lạc với
hệ sợi sinh dưỡng phát triển,
bào tử trần hoặc
bào tử sinh ra trong hoặc trên các bào tử đặc
biệt 2
2a. Bào tử sinh
ra trong túi bào tử NẤM TÚI
(ASCOMYCETES)
2b. Bào tử hoặc
bào tử trần không sinh ra trong túi bào
tử 3
3a. Hệ sợi không
có hoặc có rất ít vách ngăn, thường rộng;
bào tử kín sinh ra trong các nang bào tử kín NẤM
TIẾP HỢP
(ZYGOMYCETES)
3b. Sợi nấm
thường có vách ngăn, bào tử trần không sinh
ra trong các nang
bào tử kín. NẤM BẤT TOÀN (DEUTEROMYCETES)
I. LỚP NẤM
TIẾP HỢP (ZYGOMYCETES)
Đối với
nấm mốc thuộc lớp nấm tiếp hợp có thể dụng các
chuyên luận phân loại sau:
- Kerry
L.Odonnell, 1979 – Zygomycetes in culture Department
of Botany, University of Georgia.
- M.A.A.
Schipper, 1973 – A study on variability in
Mucorhemalis and related spicies. Studies in
Mycology, No. 4
- M.A.A.
Schipper, 1978 – On certain species of Mucor with a
key to all accepter species. Studies in Mycology,
No. 17
- M.A.A.
Schipper, 1984 – A revision of the genus Rhizopus –
Studies Mycology, No. 25
II. LỚP NẤM
BẤT TOÀN (DEUTEROMYCETES)
* Nấm
bất toàn là gì:
- Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính ( Anamorph) của
nấm túi hoặc nấm đảm.
1. Đặc
điểm đặc trưng:
Gồm
các loài nấm mốc gây ô nhiễm thực phẩm, có nhiều
loài sinh độc tố (mycotoxin), các chi, loài của lớp
nấm này được phân loại theo giai đoạn sinh sản vô
tính (anamorph) tuy vậy ở một số loài người ta phát
hiện thấy có giai đoạn sinh sản hữu tính
(Teleomorph- bào tử túi hoặc bào tử đảm).
Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát
sinh của bào tử trần của Hughes (1953). Lớp nấm bất
toàn được chia thành 3 nhóm:
- Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có
túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tử trần ở trên các
sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó
giá).
- Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá
hoặc đĩa giá, giá bào tử trần ở trong các thể quả
(Fruit - body) gọi là các conidiomata.
- Nhóm Agonomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có
bào tử trần.
Ở đây
chúng tôi giới thiệu 2 khoá phân loại đến chi của
lớp nấm bất toàn.
2. Phân
lớp của nấm bất toàn:
2.1.
Hyphomycetes (1700 chi, 11000 loài)
- Các dạng hệ sợi nấm mang các bào tử trên sợi riêng
rẽ hoặc trên cụm sợi nấm (như các đệm nấm, các bó
giá), nhưng không ở trong các conidiomata (fruit
body) riêng biệt.

2.2.
Coelomycetes (700 chi, 9000 spp) riêng rẽ
- Bào tử trần sinh ra trong các túi giá, đĩa
giá, túi giá dạng cốc hoặc đệm giá.


1. Bào
tử trần, 2. Tế bào sinh bào tử trần,
3. Cuống sinh bào
tử trần, 4. Sợi nấm
Cơ quan sinh sản
vô tính của chi Penicillium
3. Những bộ phận
sinh sản vô tính.
3.1. Hypha
(sợi nấm) số nhiều của Hyphae.
- Một
trong các sợi trong hệ nấm là các tản của một sợi
nấm. Các tản khác biệt với các phần sợi sinh dưỡng
hấp phụ chất dinh dưỡng.
3.2. Bào tử
trần:
- Một loại
bào tử vô tính, không chuyển động (Zoospose) đặc
biệt. Một loại phát tán.
3.3. Tế bào
sinh bào tử trần:
- Một tế
bào bất kỳ mà từ đó một bào tử được sinh ra trực
tiếp.
3.3.1. Các
kiểu phát sinh bào tử trần.
a. Tản: - Tản
toàn bộ
- Tản
bên trong
b. Nảy mầm: - Nảy
mầm toàn thể
-
Nảy mầm từ trong

a-b. Dạng tản. a-
Tạo chuỗi. b- Đơn độc
a-f.
Dạng phát sinh kiểu nảy chồi (blastic) a. Nảy chồi
đơn độc, b. Tạo thành chuỗi, c. Các Bào tử được tạo
thành cùng một lúc, d. Các bào tử có đáy hẹp,
e. Đáy
bằng, f. Các bào tử chui qua lỗ
3.3.2. Các kiểu phát triển bào tử trần trong sự phát
sinh bào tử dạng nảy chồi (blastic),(Theo Katsuhiko
Ando, 2002).
* Sự
phát sinh bào tử phân cắt hoàn toàn (ngoại sinh)
a. Kiểu
bào tử đính (Aleurio - type).
- Một
điểm trên tế bào sinh
bào tử
trần, bào tử đơn độc
b. Kiểu nảy chồi
(Blasto - type)
- Cấu trúc màng
đỉnh ở vị trí trên
tế bào sinh bào
tử trần và chuỗi bào tử
với một vị trí
để tạo thành mộ chuỗi
liên tiếp không
phân nhánh (chuỗi gốc già)
* Phát sinh
bào tử nội sinh.
c. Dạng bình
(Phialo - type)
- Các chuỗi bào
tử ra khỏi tế bào
sinh bào tử trần
ở cùng một vị trí,
đôi khi trong các
chuỗi rời tế bào có thay đổi.
d. Dạng phân đốt
(Annello - type)
- Các chuỗi bào
tử ra khỏi tế
bào sinh bào tử
trần ở các vị trí cao hơn,
thỉnh thoảng
trong các chuỗi rời,
tế bào có thay
đổi.
3.4. Vị trí
sinh bào tử trần ở tế bào sinh bào tử trần:
a. Một vị trí
- Bào tử trần
phát triển ở một
vị trí trên tế
bào sinh bào tử trần.
b. Nhiều vị trí
- Bào tử trần
phát triển ở các vị trí
khác nhau trên
tế bào sinh bào tử trần.
3.5. Sự phát
triển của các tế bào sinh bào tử trần:
a. ổn định
- Kích thước của
tế bào sinh bào tử trần là ổn định
b. Kéo dài
- Tế bào sinh bào
tử trần phát triển
cùng với sự sản
sinh các bào tử trần
c. Giảm dần
- Độ dài các tế
bào sinh bào tử trần
giảm đi khi mỗi
bào tử trần được sinh ra
3.6. Cuống
sinh bào tử trần:
- Một sợi
nấm phân nhánh hoặc đơn giản (một sợi nấm sinh sản)
mang hoặc gồm có các tế bào sinh bào tử trần mà từ
đó các bào tử trần được sinh ra. Đôi khi được dùng
khi mô tả những cấu trúc biến đổi đối với các tế bào
sinh bào tử trần.
3.6.1. Cuống
sinh bào tử trần không có, tế bào sinh bào tử trần
gồm các tế bào sợi nấm.
a. Cuống sinh bào
tử trần không có,
tế bào sinh bào
tử trần nằm trên sợi nấm.
b. Không có cuống
sinh bào tử trần
hoặc không rõ.
c. Cuống sinh bào
tử trần có hoặc
không có vách
ngăn,
đơn giản không
phân nhánh.
d. Cuống sinh bào
tử trần kéo dài
cùng với việc
sinh bào tử trần.
e. Cuống có vách
ngăn, phát triển
đơn độc hoặc phân
nhánh
f. Bó cuống bào
tử trần (Synemata).
Gồm một nhóm các
cuống sinh bào tử trần
bó chặt hoặc
lỏng mang các bào tử trần
ở đỉnh hoặc cả
đỉnh và bên cạnh cuống.

3.7.Bào tử
trần (conidia)
3.7.1. Hình
dáng của bào tử trần
a. Hình
dạng đơn giản:
Ví dụ:
Cầu, gần cầu, elip, hình quả thận.
b. Bào tử
sợi:
- Tỷ lệ chiều
dài và rộng của bào tử = 15:1.
c. Bào tử
vách lưới
- Bào tử được
chia nhỏ ra bởi các vách ngăn chéo nhau.
d. Bào tử
xoắn ốc
- Trục bào tử
uốn cong hơn 1800.
e. Bào tử
dạng chữ thập
- Bào tử có
nhiều trục, có mấu, có lông mềm chiếm 1/4 chiều dài
của bào tử.

3.7.2. Số các
tế bào của bào tử trần:
a.
Bào tử không vách:
Bào tử không có
vách ngăn.
b. Bào tử
kép (dính đôi):
Bào tử một vách
ngăn.
c. Bào tử
vách:
Bào tử có hai
vách ngăn trở lên.
3.7.3. Màu của
bào tử trần:
- Trong suốt
hoặc có màu (nâu, nâu đen…).
3.7.4. Bề mặt
của bào tử trần:
- Gai, hạt, có
mấu, nhẵn...
3.7.5. Kích
thước của bào tử trần:
(35-)50-200(-300) x (2,0-)2,5-3,5(-4,5)àm.
3.7.6. Các
hình dạng khác nhau của bào tử.

1. Hình cầu,
2. Gần cầu, 3. Hình bánh quy, 4. Hình giọt lệ, 5.
Hình trứng,
6. Hình trứng
ngược, 7. Quả lê, 8. Quả lê ngược, 9. Elíp, 10. Hình
elíp chữ nhật, 11. Hình thoi, 12. Hình thoi méo, 13.
Elíp nhọn đầu, 14. Hình thoi tròn đầu,
15. Dạng
thuyền, 16. Hình quả thận, 17. Dạng xúc xích

1. Dạng kim,
2. Dạng quăn, 3. Dạng chữ S, 4. Dạng chỉ, 5. Dạng
que, 6. Hình trụ, 7. Hình chữ nhật thuôn, 8. Hình
thùng, 9. HÌnh mũ, 10. Hình có vành,
11. Hình
chuỗi, 12. Hình củ có mấu, 13. Hình góc cạnh, 14.
Hình quả dâu,
15. 16. Dạng
xù xì, 17. Dạng gai.