Mặc dầu
đa số vi sinh vật là có ích và cần thiết cho nhân loại, nhưng hoạt động
của vi sinh vật cũng có thể gây nên nhiều tác hại cho con người. Chẳng
hạn như việc gây nên các bệnh tật cho người, gia súc, gia cầm, việc làm
hư hỏng thực phẩm, nguyên vật liệu... Vì vậy chúng ta phải nắm vững các
phương pháp để tiêu diệt hoặc ức chế các vi sinh vật có hại, làm giảm
bớt các thiệt hại do chúng gây nên. Chủ yếu là : (1) - Tiêu diệt các vi
sinh vật gây bệnh và cản trở sự lan truyền của chúng. (2) - Giảm bớt
hoặc hạn chế các vi sinh vật gây ô nhiễm nguồn nước, thực phẩm và phá
hủy các nguyên vật liệu khác.
Trong một
thời kỳ rất dài, từ khi chưa biết đến sự tồn tại của vi sinh vật thì tổ
tiên chúng ta đã biết không ít các biện pháp để tiêu độc và diệt khuẩn.
Người Cổ Ai Cập đã biết dùng lửa để diệt khuẩn, dùng các chất tiêu độc
để xử lý các vật thối rữa. Người Cổ Hy Lạp đã biết cách xông lưu huỳnh
để bảo quản các vật liệu kiến trúc. Người Hê-Brơ (Hebrews) đã có luật
thiêu hủy toàn bộ quần áo của những người bị bệnh hủi. Hiện nay, việc
nắm vững các kỹ thuật tiêu diệt vi sinh vật vẫn hết sức quan trọng,
chẳng hạn như việc sử dụng kỹ thuật vô khuẩn trong nghiên cưứ vi sinh
vật, việc bảo quản lương thực, thực phẩm, việc phòng chống các bệnh
truyền nhiễm...
Có những
hóa chất không làm chết được vi sinh vật nhưng có thể ức chế sự sinh
trưởng của chúng. Có thể thường gặp các chất ức chế vi khuẩn
(bacteriostatic), chất ức chế nấm (fungistatic), theo gốc Hy Lạp thì
statikos là đình chỉ.
Tất cả
các chất nói trên thường định nghĩa dựa trên ảnh hưởng đối với các vi
sinh vật gây hại. Có loại giết chết, có loại ức chế, nhưng trong hầu hết
các trường hợp đều làm giảm tổng số vi sinh vật nói chung (không chỉ
riêng đối với các vi sinh vật gây bệnh).
Dưới tác
dụng của một số nhân tố gây chết quần thể vi sinh vật không chết ngay
toàn bộ. Giống như sự sinh trưởng của quần thể , sự chết của quần thể vi
sinh vật thường xảy ra theo phương thức chỉ số (exponential) hay phương
thức logarit (logarithmic). Có nghĩa là quần thể vi sinh vật sẽ giảm
xuống tương ứng với khoảng cách thời gian.
Lấy thời
gian gây chết là trục hoành ta có được đường biểu thị là một đường
thẳng. Sau khi giảm đa số vi sinh vật sống thì tốc độ chết của vi sinh
vật cũng giảm. Đó là vì tính đề kháng khá cao của các vi sinh vật sống
sót.
Để
nghiên cứu hiệu lực của nhân tố gây chết phải xác định khi nào thì vi
sinh vật chết. Đó là chuyện rất khó, vì khó xác định được đối với từng
tế bào.Sau khi đưa vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy trong điều kiện có
thể sinh trưởng bình thường mà thấy chúng không sinh trưởng được thì
chứng tỏ là chúng đã chết. Với virus nếu không cảm nhiễm được nữa vào
vật chủ bình thưởng thì cũng chứng tỏ là đã chết.
Làm chết
và ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật không đơn giản, bởi vì nhân tố
kháng vi sinh vật (nhân tố làm chết hoặc ức chế sự sinh trưởng của vi
sinh vật) là chịu ảnh hưởng của ít ra là 6 yếu tố sau đây:
Vì trong mỗi khoảng cách thời gian số lượng vi sinh
vật chết theo một cấp số bằng nhau, cho nên thời gian làm chết
một lượng lớn vi sinh vật sẽ dài hơn so với một lượng nhỏ vi
sinh vật. Có thể tham khảo số liệu ở bảng 15.1 và hình 15.1.
Cùng nguyên lý như vậy đối với các nhân tố hóa học kháng vi sinh
vật.
các vi sinh vật khác nhau có tính mẫn cảm khác nhau
với một nhân tố gây chết: Vì vậy cùng một nhân tố gây chết trong
các tình huống khác nhau, với các loài vi sinh vật khác nhau thì
hiệu quả tác dụng cũng rất khác nhau. Ví dụ, bào tử của vi sinh
vật có tính đề kháng cao hơn rõ rệt so với các tế bào dinh dưỡng
và các tế bào non. Một số loài vi sinh vật có tính chống chịu
cao hơn so với các ảnh hưởng bất lợi của các loài khác. Ví dụ vi
khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao có tính chống chịu
với các nhân tố kháng vi sinh vật cao hơn so với các vi khuẩn
khác.
Thông thường (không phải mọi
trường hợp) nồng độ càng cao của một nhân tố hóa học hay cường
độ càng cao của một nhân tố vật lý làm cho tốc độ vi sinh vật
chết càng nhanh. Nhưng hiệu suất của các nhân tố không phụ thuộc
trực tiếp vào nồng độ và cường độ. Trong một phạm vi tương đối
nhỏ thì một sự tăng nhỏ về nồng độ và cường độ có thể làm tăng
hiệu ứng gây chết của nhân tố kháng vi sinh vật. Vượt qua khoảng
xa hơn thì tiếp tục nâng cao nồng độ và cường độ không làm tăng
tốc độ gây chết vi sinh vật. Có lúc, ở nồng độ thấp hơn lại có
hiệu quả cao hơn, ví dụ cồn 70% có hiệu quả diệt khuẩn cao hơn
cồn 95%, bởi vì hoạt tính của chúng được nâng cao khi có mặt của
nước. Có tài liệu cho rằng với nồng độ cồn cao phần protein bên
ngoài tế bào vi khuẩn sẽ ngưng tụ lại làm thành một vỏ bọc che
chở cho vi khuẩn.
Thời gian tác dụng của nhân tố kháng vi sinh vật càng dài thì số
lượng vi sinh vật chết càng nhiều (hình 15.1). Để đạt đến
mục đích diệt khuẩn thì thời gian tác dụng phải đủ để cho tỷ lệ
sống sót chỉ còn 10-6 hoặc thấp hơn nữa.
Tăng nhiệt
có thể làm tăng hiệu quả hoạt tính của hóa chất. Thông thường
với một nồng độ thấp của chất tiêu độc (disinfectant) hay nhân
tố diệt khuẩn cần xử lý ở nhiệt độ cao hơn.
Việc khống chế quần thể vi sinh vật không tách rời
mà gắn với các nhân tố môi trường, hoặc làm tăng hay làm giảm
tác động gây chết. Ví dụ trong điều kiện acid, nhiệt độ có hiệu
quả diệt khuẩn cao hơn, do đó đối với các đồ uống có tính acid
như nước quả, nước cà chua thì dễ diệt khuẩn theo kiểu Pasteur
(pasteurise) hơn so với các thực phẩm có pH cao hơn như là sữa
chẳng hạn. Nhân tố môi trường quan trọng thứ hai là một số chất
hữu cơ có thể bảo vệ vi sinh vật đề kháng với tác dụng của nhiệt
độ hay của các chất tiêu độc hóa học. Màng sinh học (biofilm) là
một ví dụ rất rõ. Các chất hữu cơ trên bề mặt của màng sinh học
sẽ bảo vệ các vi sinh vật tạo thành màng sinh học, cho nên màng
sinh học và các vi sinh vật trong đó rất khó trừ khử. Vì vậy
trước khi diệt khuẩn hay tiêu độc một số vật phẩm trước hết cần
rửa sạch. Đối với ống tiêm và các dụng cụ y khoa hay nha khoa
trước khi diệt khuẩn cần phải rửa sạch để tránh sự có mặt quá
nhiều chất hữu cơ giúp bảo vệ cho mầm bệnh và làm tăng nguy cơ
nhiễm khuẩn. Khi chế tạo nước uống cũng cần chú ý là nguồn nước
thành phố vẫn còn chứa khá nhiều chất hữu cơ cho nên cần dùng
nhiều chlorine mới đủ sức tiêu độc
Tăng
nhiệt và việc dùng các phương pháp vật lý khác thường được dùng để diệt
khuẩn. Các phòng thí nghiệm vi sinh vật đều dùng các nồi hấp áp suất cao
(autoclave) để diệt khuẩn. Tăng nhiệt, qua lọc, chiếu tia tử ngoại, dùng
bức xạ điện ly là 4 phương pháp vật lý thường được sử dụng.
Người Cổ
Hy Lạp đã biết dùng lửa hay đun nước sôi để diệt khuẩn hay tiêu độc.
Tăng nhiệt đến nay vẫn là phương pháp thường dùng nhất để diệt khuẩn.
Chủ yếu có phương pháp dùng sức nóng ẩm và sức nóng khô.
(Theo sách
của Prescott, Harley và Klein)
Vì tăng
nhiệt là biện pháp rất quan trọng để khống chế vi sinh vật cho nên cần
có một tiêu chuẩn chính xác đối với hiệu suất diệt khuẩn bằng sức nóng
(heat-killing efficiency). Trước đây dùng điểm gây chết do nhiệt
(thermal death point, TDP). Đó là nhiệt độ thấp nhất đủ để diệt hết vi
sinh vật trong dịch huyền phù (suspention) sau 10 phút. Nhưng vì vi sinh
vật chết theo phương thức logarit, cho nên trên lý thuyết không có thể
tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật trong một mẫu vật, tức là phải kéo dài
thời gian tăng nhiệt. Vì vậy có một phương thức biểu thị chính xác hơn
và đã được tiếp nhận rộng rãi, đó là Thời gian giảm thiểu thập phân
(decimal reduction time, D) hoặc gọi là Trị số D (D value). Trị số D là
thời gian cần thiết để diệt hết 90% vi sinh vật hoặc bào tử trong một
mẫu vật ở một nhiệt độ nhất định. Trên một đồ thị bán logarit
(semilogarithmic plot) thấy rõ số lượng vi sinh vật biến đổi theo thời
gian tăng nhiệt (hình 15.2). Trị số D là thời gian cần thiết để
số lượng vi sinh vật giảm 10 lần. Trị số D liên quan đến tính đề kháng
của vi sinh vật đối với các nhiệt độ khác nhau. Từ trị số D mà tính ra
trị số Z (Z value). Trị số Z là nhiệt độ tăng lên đủ để làm giảm 1/10
trị số D. Một cách biểu thị khác là trị số F (F value) đó là thời gian
cần thiết (tính bằng min.) đủ để diệt hết một quần thể tế bào hoặc bào
tử ở một nhiệt độ nhất định (thường là 121°C).

Hình
15.2: Tính toán trị số Z
Căn cứ
vào trị số D ở các nhiệt độ khác nhau để tính ra trị số Z. Trị số Z có
thể dùng để tính toán mối quan hệ giữa nhiệt độ và thời gian sống sót
của vi sinh vật. Trị số Z là số nhiệt độ tăng đủ để làm giảm 10% trị số
D. Trong đồ thị này trị số Z là 10,50C. Trị số
D biểu thị bằng thang logarit. (Theo sách của Prescott, Harley và
Klein).
Trị số D và
trị số Z được ứng dụng rộng rãi trông công nghiệp chế biến thực phẩm.
Khi sản xuất đồ hộp cần xử lý nhiệt sau khi đưa thực phẩm vào hộp và hàn
hộp lại. Cần xử lý nhiệt để đủ mức diệt được vi khuẩn gây ngộ độc thịt
Clostridium botulinum. Vi khuẩn này gây ra độc tố botulism rất nguy
hiểm. Xử lý nhiệt độ đủ dài để làm cho số lượng bào tử của vi khuẩn này
nếu có từ 1012 giảm xuống chỉ còn 1 bào tử (10°).
Trị số D đối với bào tử vi khuẩn này ở 121°C là 0,204 min.,
vì vậy để tiêu diệt 1012 bào tử xuống còn 1 bào tử cần 12D
hay 2,5 phút. Trị số Z đối với Clostridium botulinum là 10°C
- tức là tăng 10°C thì giảm được 10 lần trị số D. Nếu diệt
khuẩn ở 111°C thì trị số D phải tăng 10 lần, tức là 2,04 phút
và trị số 12D tăng lên đến 24,5 phút . Bảng 15.3 nêu lên trị số D
và trị số Z của một số vi khuẩn thường gặp trong thực phẩm.
Bảng 15.3:
Trị số D và trị số Z của một số vi khuẩn gây bệnh gặp trong thực phẩm
Vi sinh
vật |
Cơ chất |
D(°C),phút |
Z (°C) |
Clostridium botulinum |
Đệm phosphat |
D121=0,204 |
10 |
Cl.perfringens (chủng
kháng nhiệt) |
MT nuôi cấy |
D90=3-5
|
6-8 |
Salmonella |
Sản phẩm gà |
D60=0,39-0,40 |
4,9-5,1 |
Staphylococcus
aureus |
Sản phẩm gà
SP gà tây
Dung dịch NạCl 0,5% |
D60=5,17-5,37
D60=15,4 D60=2,0-2,5 |
5,2-5,8
6,8
5,6 |
(Theo sách
của Prescott,Harley và Klein)
Có 3 số
liệu đối với tụ cầu vàng (S.aureus), cho thấy tốc độ làm chết vi
khuẩn này thay đổi phụ thuộc vào môi trường và hiệu quả bảo vệ của chất
hữu cơ.
Với sức
nóng ẩm phải cần nhiệt độ cao hơn 100°C thì mới có thể diệt
được nội bào tử (endospores) của vi khuẩn, và cần có áp suất cao trong
điều kiện bão hòa hới nước. Thiết bị diệt khuẩn thường dùng được gọi là
autoclave (hình 15.3)

Hình 15.3: Hai
loại autoclave nhỏ và lớn
Về cơ bản
autoclave cũng tương tự như nồi hầm chịu áp lực vẫn thường dùng trong
gia đình. Tùy yêu cầu mà có cái dùng lửa, có cái dùng điện, có cái dùng
hơi nước chuyển vào, có cái nhỏ, có cái vừa, có cái lớn hoặc rất lớn.
Autoclave do nhà khoa học Chamberland phát minh ra vào năm 1884 và phát
minh này đã thúc đẩy sự phát triển của Vi sinh vật học. Autoclave phải
có van để đẩy hết không khí ra và trong nồi chỉ còn có hơi nước bão hòa.
Có thể đóng van ngay từ đầu đợi áp lực nâng lên một ít rồi mới mở van để
loại hết không khí ra. Cũng có thể mở van ngay từ đầu, khi thấy hới nước
bay ra nhiều mới đóng van lại. Thường diệt khuẩn ở 121°C (áp
suất 15 pounds) trong 15 phút. Có thể diệt hết mọi tế bào vi sinh vật và
bào tử.
Diệt
khuẩn bằng sức nóng ẩm thông qua việc phá hủy acid nucleic, làm biến
tính enzym và các protein khác, đồng thời còn có thể phá vỡ màng tế bào
mà làm chết vi sinh vật.
Diệt
khuẩn bằng sức nóng ẩm phải tiến hành triệt để mới có hiệu quả. Khi chưa
loại bỏ hết không khí thì ở áp suất 15 pounds nhiệt độ không thể đạt đến
121°C. Các vật cần xử lý không nên xếp chật quá cản trở việc
tiếp xúc với hơi nước nóng. Lúc diệt khuẩn một bình có thể tích lớn thì
phải giữ thời gian dài hơn, để làm cho toàn bộ dịch thể phải đạt tới 121°C.
Chẳng hạn khi diệt khuẩn ở bình 5 lít thì phải xử lý trong 70 phút. Để
khắc phục các nhân tố nói trên người ta thường xếp kèm với sinh vật chỉ
thị khi diệt khuẩn các vật phẩm. Khi đó dùng ống (ampule) chứa môi
trường dinh dưỡng vô khuẩn có thêm mảnh giấy có tẩm bào tử vi khuẩn
Bacillus stearothermophilus hay Clostridium. sp PA3679. Diệt
khuẩn xong phá vỡ ống trong điều kiện vô khuẩn và nuôi cấy vài ngày. Nếu
sinh vật chỉ thi không sinh trưởng thì là việc diệt khuẩn đã thành công.
Người ta
thường xử lý nhiệt ở độ sôi đối với sữa và nhiều chất khác. Phương pháp
này gọi là phương pháp khử trùng Pasteur (Pasteurization) để kỷ niệm
phát minh này của ông. Vào thập kỷ 60 của thế kỷ 19 do rượu vang bị
nhiễm khuẩn, gây khó khăn cho việc bảo quản và vận chuyển, gây khó khăn
cho việc sản xuất rượu vang ở Pháp. Pasteur đã dùng kính hiển vi quan
sát thấy các trong rượu bị ô nhiễm có mặt các vi khuẩn lên men lactic và
acetic. Ông thấy xử lý ở nhiệt độ 55-60°C có thể làm chết các
vi sinh vật này và có thể bảo quản tương đối lâu dài rượu vang. Năm 1886
hai nhà hóa học Đức là V.H. Soxhlet và F.Soxhlet sử dụng kỹ thuật này để
bảo quản sữa và làm giảm việc sữa lây truyền mầm bệnh. Năm 1889 phương
pháp tiêu độc Pasteur với sữa được nhập vào Hoa Kỳ và người ta đã dùng
phương pháp này để xử lý sữa, bia, và nhiều loại bđồ uống khác. Phương
pháp tiêu độc Pasteur không đạt tới mục đích diệt khuẩn nhưng đủ làm
chết các vi khuẩn gây bệnh, giảm mạnh các vi khuẩn không gây bệnh nhưng
làm hư hỏng thực phẩm và làm chậm rõ rệt tốc độ biến chất của thực phẩm.
Có thể có
hai phương pháp khử trùng sữa. Phương pháp tương đối cổ là xử lý ở 63
°C trong 30 phút. Còn phương pháp hiện thường được sử dụng là
phương pháp khử trùng ngắn (flash Pasteurization), còn gọi là phương
pháp khử trùng ngắn ở nhiệt độ cao (high-temperature short-term, HTST),
tức là xử lý ở 72°C chỉ trong 15 giây, sau đó nhanh chóng làm
lạnh. Trong công nghiệp thực phẩm có lúc cũng còn dùng phương pháp khử
trùng siêu nhiệt (ultrrahigh temperature, UHT), tức là xử lý sữa và các
sản phẩm sữa ở nhiệt độ 140-150°C chỉ trong 1-3 giây. Sữa xử
lý siêu nhiệt không cần bảo quản lạnh, có thể bảo quản hai tháng an toàn
ở nhiệt độ phòng. Các gói cà phê kem (coffee creamer) cung cấp ở khách
sạn thường được diệt khuẩn theo phương pháp này.
Nhiều vật
phẩm có thể diệt khuẩn bằng sức nóng khô (dry heat sterilization). Đưa
các vật phẩm này vào tủ sấy và giữ nhiệt độ 160-170°C trong
2-3 giờ. Vi sinh vật bị chết do bị oxy hóa các thành phần tế bào, và làm
biến tính protein. Mặc dầu diệt khuẩn bằng sức nóng khô không có hiệu
quả cao như bằng sức nóng ẩm. Bào tử của vi khuẩn Clostridium
botulinum bị chết ở 121°C sau 5 phút khi dùng sức nóng ẩm
nhưng chỉ bị chết như vậy ở 160°C sau 2 giờ. Diệt khuẩn bằng
sức nóng khô có những ưu thế riêng vì không làm ăn mòn các vật liệu thủy
tinh và kim loại như sức nóng ẩm, có thể dùng để xử lý các dạng bột, dầu
và các chất tương tự. Hầu hết các phòng thí nghiệm xửn lý hộp Petri và
các pipét bằng sức nóng khô. Không thích hợp sử dụng phương pháp này để
xử lý các vật phẩm bằng chất dẻo và cao su.

Hình 15.4: Tủ
sấy nhiệt độ khô
15.4.2.
Nhiệt độ thấp
Nhiệt độ
thấp được sử dụng để ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh
vật. Đây là phương pháp quan trọng ngành vi sinh vật học thực phẩm. Ở
nhiệt độ -20°C hay thấp hơn, vật phẩm bị đông lạnh, vi sinh
vật bị đình chỉ sinh trưởng. Một số vi sinh vật bị chết vì các tinh thể
băng là phá vỡ màng tế bào,.nhưng lạnh sâu không làm chết phần lớn các
vi sinh vật nhiễm trên vật phẩm. Trên thực tế nhiều phòng thí nghiệm
dùng các tủ lạnh sâu -30°C hay -70°C để bảo quản
vi sinh vật. Vì thực phẩm đông lạnh có thể chứa nhiều vi sinh vật, cho
nên khi làm tan băng phải xử lý ngay để tiêu thụ, tránh để tổn hại và để
cho các vi sinh vật gây bện phát triển.
Bảo quản
lạnh giúp làm chậm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, nhưng
không đủ làm ngừng hẳn sự sinh trưởng. Đáng mừng là phần lớn các vi sinh
vật gây bệnh là thuộc loại ưa ấm (mesophilic) và không sinh trưởng được
ở nhiệt độ 4°C. Các vật giữ lạnh bị hư hỏng bởi các vi khuẩn
ưa lạnh (psychrophilic) và chịu lạnh (psychrotrophic) nhất là khi có tồn
tại nước, các tủ lạnh chỉ dùng để bảo quản ngắn hạn thực phẩm và các vật
phẩm khác.
15.4.3. Qua
lọc
Phương
pháp qua lọc là phương pháp rất tốt để giảm thấp quần thể vi sinh vật
đối với các vật liệu mẫn cảm với nhiệt độ và nhiều khi có thể dùng để
diệt khuẩn các dung dịch. Qua lọc chỉ đơn giản là loại vi sinh vật khỏi
dung dịch chứ không phải là diệt khuẩn. Có hai loại lọc vi sinh vật.
Thiết bị qua lọc tầng sâu (depth filter): đó là loại thiết bị cấu tạo
bởi sợi hay các vật chất dạng hạt, tạo thành một bản lọc khá dầy với
những lỗ rất nhỏ. Dưới sức hút chân không dung dịch sẽ được lọc qua còn
vi sinh vật bị giữ lại hay bị hấp phụ (adsorption) trên bề mặt bản lọc.
Nguyên liệu để làm ra bản lọc này thường là đất Tảo silic (dimatomaceous
earth) - đó là thiết bị lọc Berkefield. Còn có thể dùng một loại sứ
(unglazed porcelain) - đó là thiết bị lọc Chamberlain. Hoặc còn có thể
dùng thạch miên (asbestos) hay các nguyên liệu khác.
Gần
đây người ta dùng thiết bị màng lọc (membrane filters) thay thế cho
thiết bị qua lọc tầng sâu. Màng lọc hình tròn, dày khoảng 0,1mm và được
chế tạo bởi acetate cellulose, nitrate cellulose, polycarbonate,
fluoride polyvinylidene hay các chất tổng hợp khác. Các màng lọc có lỗ
với đường kính khoảng 0,2μm là có thể dùng để lọc bỏ phần lớn các tế bào
dinh dưỡng của vi sinh vật, trừ virus. Dịch lọc thường chỉ từ 1ml đến
vài lít. Màng lọc được lắp cố định trên một giá đặc biệt (hình 15.5)
Dưới áp
lực của máy hút chân không dịch lọc được chuyển sang một bình vô khuẩn.
Loại thiết bị màng lọc này được dùng trong ngành dược, lọc thuốc đau
mắt, chuẩn bị các môi trường nuôi cấy, các loại dầu, chất kháng sinh và
nhiều vật chất kém chịu nhiệt khác.

Hình 15.5:
Thiết bị màng lọc
- Bình Erlenmeyer đựng dịch
cần lọc
- Dịch lọc được đẩy sang
thiết bị màng lọc nhờ máy bơm
- Thiết bị màng lọc (với
các loại hình các kích cỡ khác nhau).
Phương
pháp diệt khuẩn nhờ lọc còn dùng để lọc không khí. Hai ví dụ thường gặp
là khẩu trang dùng trong ngoại khoa và nút bông dùng cho các ống nghiệm
hay các bình nuôi cấy vi sinh vật. Không khí đi qua được nhưng vi sinh
vật thì bị giữ lại bên ngoài. Phòng cấy Laminar thoáng khí nhưng an toàn
sinh học (Laminar flow biological safety cabinet) đã sử dụng màng lọc
không khí bằng các hạt hiệu lực cao HEPA (high-efficiency particulate
filter). Nó có thể lọc được đến 99,97% các hạt có kích thước 0,3μm và
được coi là một hệ thống lọc rất quan trọng. Người nuôi cấy vi sinh vật
có thể thao tác thoải mái trong một phòng cấy mở một phần cửa nhưng rất
an toàn nhờ luôn có một luồng không khí vô khuẩn được thổi từ phía trong
và lại thoát ra qua màng lọc HEPA đặt ở phía trên. Khi thao tác với các
vi sinh vật nguy hiểm như vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis, virus
gây ung thư, các ADN tái tổ hợp... nhất thiết cần sử dụng phòng cấy này.
Thiết bị này được dùng trong các phòng thí nghiệm, trong công nghiệp,
như là công nghiệp dược phẩm, để chuẩn bị môi trường, thao tác thí
nghiệm, nuôi cấy mô…

Hình 15.6:
Phòng cấy Laminar
15.4.4. Bức
xạ (radiation)
Bức xạ tử
ngoại (Ultraviolet radiation-UV) với bước sóng 260nm có hiệu ứng diệt
khuẩn rất mạnh, tuy nhiên không có khả năng xuyên qua thủy tinh, các
màng bẩn, nước và một số cơ chất khác. Vì vậy UV chỉ dùng để diệt khuẩn
trong một số trường hợp, ví dụ diệt khuẩn không khí trong tủ cấy, phòng
nuôi cấy hoặc bền ngoài một số vật thể. UV có hại đối với da và mắt cho
nên phải tắt đèn UV trước khi vào làm việc nơi có đèn này. UV cũng có
thể dùng để diệt khuẩn nước, phải là một tầng nước mỏng đi qua đèn UV để
đủ sức diệt mầm bệnh và các vi sinh vật khác..
Bức xạ
ion hóa (ionizing radiation) hay bức xạ điện ly có sức xuyên rất mạnh và
được dùng rất tốt để diệt khuẩn. Nó có thể diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫn
bào tử vi khuẩn, cả vi sinh vật nhân nguyên thủy (procaryotic) lẫn các
vi sinh vật có nhân thật (eucaryotic). Tia gamma từ nguồn cobalt 60 được
dùng để diệt khuẩn nguội đối với chất kháng sinh, kích tố (hormones),
chỉ khâu vết thương, các vật liệu y học bằng chất dẻo (plastic) như ống
tiêm... Tia gamma còn được diệt khuẩn và tiêu độc (pasteurize) đối với
thịt và các thực phẩm khác. Bức xạ ion hóa có thể diệt các vi khuẩn gây
bệnh nguy hiểm như Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus,
Campylobacter jejuni... Cả cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ
(FDA) lẫn tổ chức Y tế thế giới (WHO) đều xác định tính an toàn của việc
chiếu xạ này đối với thực phẩm. Đã có một nhà máy chiếu xạ thương phẩm ở
gần Tampa (bang Florida). Tiếc rằng phương pháp này chưa được ứng dụng
rộng rãi tại Hoa Kỳ, nguyên nhân là do giá còn cao và nhiều người còn lo
ngại các ảnh hưởng bất lợi của việc chiếu xạ lên thực phẩm. Gần đây,
Chính phủ Mỹ đã phê chuẩn việc chiếu xạ lên thịt gia cầm, thịt bò, thịt
lợn, thịt bê, thịt cừu non, hoa quả, rau củ và các chất điều vị. Việc
chiếu xạ trong tương lai sẽ ngày càng được ứng dụng rộng rãi.
15.5. SỬ DỤNG
CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC ĐỂ KHỐNG CHẾ VI SINH VẬT
Mặc dầu
người ta vẫn thường dùng các phương pháp vật lý để tiêu độc nhưng các
tác nhân hóa học cũng thường được dùng để tiêu độc (disinfection) và
phòng thối (antisepsis). Có nhiều nhân tố ảnh hưởng đếnhiệu quả tiêu độc
và phòng thối bằng phương pháp hóa học. Chẳng hạn như loài vi snh vật,
nồng độ và bản chất của các chất tiêu độc và phòng thối, thời gian xử
lý,... Trước khi sử dụng các chất tiêu độc hay phòng thối thì bề mặt vật
thể phải được làm sạch. Cần đảm bảo sự an toàn khi dùng hóa chất trong
các phòng thí nghiệm hay trong bệnh viện. Hóa chất cũng được dùng để
phòng chống sự sinh gtrưởng của vi sinh vật trong thực phẩm. Có nhiều
loại hóa chất được dùng làm chất tiêu độc, mỗi loại đều có những ưu điểm
và nhược điểm riêng. Trước khi chọn sử dụng hóa chất nào phải hiểu rõ
đặc tính của chất đó. Trong trường hợp pha rất loãng và có mặt chất hữu
cơ thì chất đó vẫn có thể tác dụng có hiệu quả lên các nhân tố truyền
nhiễm (vi khuẩn Gram dương, Gram âm, vi khuẩn kháng acid, nội bào tử của
vi khuẩn, các loại nấm và virus...), mặt khác lại phải không có hại đối
với cơ thể người, không làm ăn mòn các vật phẩm nói chung. Trong thực
tiễn, rất khó đạt đến tiêu chuẩn vừa có hiệu lực vừa ít độc đối với cơ
thể. Một số hóa chất tuy hiệu lực thấp nhưng vì khá vô hại nên vẫn được
sử dụng. Chất tiêu độc phải ổn định khi bảo quản, không có mùi vị khó
chịu, tan trong nước và trong dầu để dễ xâm nhập vào vi sinh vật và phải
có sức căng bề mặt thấp để xâm nhập được vào các khe trên bề mặt. Nếu
giá không cao càng tốt.
Một vấn
đề nghiêm trọng là việc sử dụng quá mức Triclosan và các chất diệt khuẩn
(germicides) khác. Chất kháng khuẩn (antibacterial) này hiện thấy có mặt
trong các sản phẩm như chất khử mùi (deodorant), nước súc miệng, xà
phòng, thớt cắt rau, đồ chơi trẻ em... Triclosan hầu như đang có mặt
khắp nơi, hậu quả là đã xuất hiện các vi khuẩn kháng Triclosan. Ví dụ
trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa đã có thể bài xuát chất
này ra khỏi tế bào. Tương tự như trường hợp vi khuẩn phản ứng với việc
dùng quá độ thuốc kháng sinh, vi khuẩn cũng sẽ có sự đáp ứng như vậy khi
dùng quá mức các chất phòng thối. Hiện đã có bằng chứng cho thấy việc sử
dụng rộng rãi Triclosan đã làm tăng tần số xuất hiện các vi khuẩn kháng
thuốc kháng sinh. Vì vậy việc dùng quá mức các chất phòng thối
(antiseptic) có khả năng sinh ra những hậu quả khó lường.
Bảng 15.4:
Nồng độ sử dụng và mức độ hoạt tính của các chất diệt khuẩn thông dụng
Hóa chất |
Nồng độ sử dụng |
Mức độ hoạt tính* |
Dạng khí: |
|
|
Ethylene oxide |
450-500mg/L |
Cao |
Dạng
lỏng: |
|
|
Glutaraldehyde dich thể |
2% |
Tương đối cao |
Formaldehyde + cồn |
8 + 70% |
Cao |
H2O2
ổn định |
6-30% |
Tương đối cao |
Formaldehyde
dịch thể |
6-8% |
Tương đối cao |
Iodophors |
750-5000mg/L |
Tương đối cao |
Iodophors |
75-159mg/L |
Tương đối thấp |
Iodine + cồn |
0,5 + 70% |
Trung bình |
Hợp chất của Chlore |
0,1-0,5% |
Trung bình |
Hợp chất của phenol,dịch
thể |
0,5-3% |
Tương đối thấp |
Iodine, dich thể |
1% |
Trung bình |
Cồn
(ethyl, isopropyl) |
70% |
Trung bình |
Hợp chất Ammon bậc 4 |
0,1-0,2% trong nước |
Thấp |
Chlorohexidine |
0,75-4% |
Thấp |
Hexachlorophene |
1-3% |
Thấp |
Hợp chất Thủy ngân |
0,1-0,2% |
Thấp |
*Hoạt
tính cao-có thể làm chết vi khuẩn kể cả vi khuẩn lao, bào tử, nấm,
virus; Hoạt tính trung bình- làm chết mọi vi khuẩn, trừ bào tử; Hoạt
tính thấp- làm chết tế bào dinh dưỡng của vi khuẩn, trừ VK lao, làm chết
nấm, virus có lượng lipid mức trung bình. Theo Symour S. Block, 1983.

Hình 15.7: Cấu
trúc của một số chất tiêu độc và chất phòng thối thông dụng
Loại Phenol
Phenol là
chất phòng thối và tiêu độc được sử dụng rộng rãi đầu tiên. Năm 1867
Joseph Lister đã dùng phenol để làm giảm nguy hiểm của việc nhiễm vi
sinh vật trong quá trtình phẫu thuật. Hiện nay phenol và các dẫn xuất
như các loại cresol, các loại xylenol và orthophenylphenol đã được dùng
để làm chất tiêu độc trong các phòng thí nghiệm và bệnh viện. Chất tiêu
độc thương mại Lysol là một hợp chất loại phenol. Các chất loại phenol
có tjhể làm biến tính protein và phá hủy màng tế bào. Chúng có ưu điểm
là có thể diệt vi khuẩn lao khi có mặt các chất hữu cơ. Sau khi sử dụng
có thể duy trì tác dụng khá lâu trên bề mặt vật thể. Nhưng chúng có mùi
khó chịu và có thể làm kích thích da.
Hexachlorophene
là một chất phòng thối thường dùng vì có thể làm giảm số lượng vi khuẩn
trên da và duy trì được khá lâu, nhưng nó lại có thể làm tổn thương não
cho nên hiện chỉ dùng trong bệnh viện khi có sự bộc phát của Tụ cầu
khuẩn Staphylococcus.
Cồn
Cồn là
một trong những loại thuốc tiêu độc và thuốc phòng thối thường dùng. Cồn
có thể làm chết cả vi khuẩn và nấm nhưng không làm chết được bào tử. Một
số virút chứa lipid cũng bị cồn làm chết. Ethanol và Isopopanol là hai
loại cồn thường dùng để diệt khuẩn, nồng độ thường dùng là 70-80%, nồng
độ này làm biến tính protein, còn có thể làm hòa tan màng lipid. Để diệt
khuẩn nhiệt kế và các dụng cụ nhỏ cần xử lý bằng cồn trong 10-15 phút.
Các Halogens
Halogen
là một trong 5 nguyên tố thuôc nhóm VIIA của bảng tuần hoàn (Fluorin-F,
Chlorine-Cl, Bromine-Br, Iodine-I và Astatine-). Ở trạng thái tự do các
phân tử tồn tại dưới dạng 2 nguyên tử liên kết với nhau. Cúng có thể tạo
thành muối với sodium (Na) hay các kim loại khác. I và Cl là hai loại
kháng vi sinh vật quan trọng. I thường được dùng làm thuốc phòng thối
(antiseptic) ngoài da. Nó làm chết vi sinh vật do oxy hóa các thành phần
tế bào, iod hóa (iodinating) các protein. Với nồng độ cao có thể làm
chết bào tử, nói chung là sử dụng tinture d’iode (tinture of iodine) -
tức là IK với nồng độ 2 % hay cao hơn iodine trong dung dịch
nước-ethanol. Mặc dầu I là chất phòng thối có hiệu quả nhưng cũng có thể
làm tổn thương da, có thể làm biến màu da, còn có thể gây dị ứng
(allergie). Gần đây người ta sử dụng iodophore - hợp chất của I với một
chất hữu cơ. Iodophore tan trong nước, không làm bẩn màu da, có thể giải
phóng dần Iodine nên giảm tổn hại và giảm kích thích da. Loại tiêu độc
da và dùng trong phòng thí nghiệm phổ biến là loại có nhãn hiệu là
Wescodyne, còn loại tiêu độc vết thương thường dùng loại có nhẫn hiệu là
Betadine.
Iodine
thường được dùng để tiêu độc nước tiêu dùng tại thành thị và các bể bơi.
Cũng được dùng trông công nghiệp sữa, công nghiệp thực phẩm. Có thể dùng
khí chlorine, sodium hypochlorite hoặc calcium hypochlorite. Khi sử dụng
chúng biến thành HClO rồi giải phóng nguyên tử oxy: Sẽ xảy ra sự oxy hóa
các tế bào dinh dưỡng của vi khuẩn, nâm nhưng không có tác dụng với bào
tử:
Cl2
+ H2O→ HCl + HClO
Ca(OCl)2
+ 2H2O → Ca (OH)2 + 2 HClO
HClO
→ HCl + O
Dưới tác
dụng của chúng hầu như tất cả vi sinh vật sẽ bị giết chết trong vòng 30
phút. Vì phản ứng của chất hữu cơ với tác động của Cl và các dẫn xuất
của Cl nên đã can thiệp vào tác dụng diệt khuẩn của Cl cho nên người ta
thường sử dụng quá lượng Cl để bảo đảm hiệu quả diệt khuẩn. Có một khả
năng là Cl phản ứng với chất hữu cơ hình thành nên những hợp chất gây
ung thư trihalomethanes, cho nên trong nước uống cần phải kiểm tra sự
tồn tại của chất này. Tại Châu Âu và Canada đôi khi người ta sử dụng
thành công ozone để thay thế cho việc chlorine hóa (chlorination).
Cl là một
chất tiêu độc tốt, khống đắt, lại dễ dàng sử dụng nên rất hay được sử
dụng. Với một lượng nước uống nhỏ có thể tiêu độc bằng những viên
halozone. Halozone (acid parasulfone dichloramidobenzoic) sau khi đưa
vào nước sẽ từ từ giải phóng ra chloride, sau khoảng nửa giờ có thể đạt
tới mục đích tiêu độc. Chất này thường được sử dụng trong trường hợp
thiếu nước sạch để uống.
Dung dịch
Cl là chất tiêu độc có hiệu quả trong gia đình và trong các phòng thí
nghiệm. Có thể dùng nồng độ pha loãng 100 lần dịch tẩy trắng gia dụng
(household bleach) phối hợp với chất tẩy không ion hóa (non ionic
detergent) sao cho nồng độ chất tẩy vào khoảng 0,8%. Hỗn hợp này vừa làm
sạch vừa loại bỏ vi khuẩn
Các Kim loại
nặng
Trong
nhiều năm các ion kim loại nặng như Hg, Ag, As, Zn và Cu thường được
dùng để làm chất diệt khuẩn (germicides). Nhiềug kim loại nặng có tác
dụng ức chế vi sinh vật (bacteriostatic) hơn là diệt khuẩn. Hiện các
chất này đã được thay thế bằng các chất khác có độc tính thấp hơn và có
hiệu quả hơn. Nhưng cũng có thường hợp ngoại lệ, ví dụ dung dịch 1% AgNO3
thường được dùng làm thuốc nhỏ mắt để phòng bệnh lậu ở mắt (trong nhiều
bệnh viện người ta dùng Erythromycin để thay thế nitrat bạc vì chất
kháng sinh này có hiệu quả chống cả Chlamydia lẫn Neisseria.
Bạc sulfadiazine thường được dùng trong điều trị bỏng. CuSO4
thường được dùng để diệt tảo có hiệu quả trong ao hồ và các bể bơi.
Kim loại
nặng kết hợp với protein , làm bất hoạt protein và cũng có thể làm kết
tủa protein của tế bào.
Các muối
ammon bậc bốn (Quaternary Ammonium Compounds)
Các chất
tẩy (Detergents - từ gốc La Tinh detergere có nghĩa là loại trừ) là những
phân tử hữu cơ được dùng làm các chất giữ âm (wetting agents) và nhũ hóa
(emulsifiers) vì chúng vừa có cực thân nước (polar hydrophilic) vừa có
những gốc phi cực kỵ nước (nonpolar hydrophobic ends). Chúng có thể làm
tan các chất khó hòa tan bởi các phương pháp khác, vì vậy dùng làm chất
tẩy rửa, giặt giũ rất có hiệu quả, nhưng cơ chế khác với các chất béo có
trong xà phòng.
Mặc dầu
các chất tẩy dạng ion có chức năng kháng vi sinh vật nhất định nhưng chỉ
có các chất tẩy rửa cationic (ion dương) mới có tác dụng tiêu độc.
Thường dùng nhất là các muối ammon bậc bốn, chúng làm phá vỡ màng tế
bào, cũng có thể làm biến tính protein.
Các chất
tẩy cationic như Benzalkonium chloride và Cetylpyridinium chloride có
thể giết chết phần lớn vi khuẩn nhưng không giết được vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis và các nội bào tử. Chúng có ưu điểm là ổn
định, không độc và không gây kích thích... nhưng lại bị mất tác dụng
trong nước cứng (hard water) và nước xà phòng. Các chất tẩy cationic
thường được dùng để làm chất tiêu độc đối với bát đĩa, các thiết bị nhỏ
và để xử lý ngoài da. Zephiran có chứa benzalkonium chloride và Ceepryn
có chứa cetylpyridinium, chloride là các mặt hàng thường gặp trên thị
trường.
Các Aldehyde
Hai loại
aldehyde thường được sử dụng là Formaldehyde và Glutaraldehyde. Chúng có
phản ứng rất mạnh, có thể kết hợp với acid nucleic và protein và làm bất
hoạt chúng, còn có thể làm bất hoạt thông qua việc liên kết chéo
(crosslinking) và alkyl hóa (alkylating). Chúng có thể làm chết bào tử,
có thể dùng làm chất diệt khuẩn hóa học. Formaldehyde thường được dùng
dưới dạng hòa tan trong nước hay trong cồn. Dung dịch đệm 2%
glutaraldehyde là một loại chất tiêu độc có hiệu quả và thường được dùng
để tiêu độc các phòng thí nghiệm và bệnh viện. Glutaraldehyd trong 10
phút đã đủ để tiêu độc nhưng để giết chết bào tử cần tới 12 giờ.
Các khí diệt
khuẩn
Có nhiều
vật phẩm không chịu được nhiệt độ cao như các đĩa Petri bằng chất dẻo,
các ống tiêm nhựa, các bộ phận của máy tim-phổi nhân tạo, các ống dẫn,
ống nói... cần diệt khuẩn bằng khío ethylene oxide (EtO). EtO có thể kết
hợp với protein, có thể làm chết cả vi sinh vật lẫn bào tử. EtO nhanh
chóng xuyên qua được các bao bì bằng chất dẻo nên là một loại chất tiêu
độc đặc biệt hiệu quả.
Tiêu độc
bằng EtO rất giống với tiêu độc trong nồi cao áp. Cần khống chế nồng độc
EtO, nhiệt độ và độ ẩm. Với EtO thuần khiết thường dùng nồng độ 10-20%
phối hợp với CO2 hay dichlorodifluorromethane. Với các vật
dụng sạch cần xử lý ở 38°C trong 5-8 giờ, nếu ở 54°C
cần xử lý trong 3-4 giờ. Nồng độ EtO là là 700mg/lít.Vì EtO có độc tính
lớn cho nên sau khi tiêu độc cần thổi khí mạnh để loại trừ hết EtO đi.
Betapropiolactone
(BPL) cũng là loại khí dùng để tiêu độc. Trong trạng thái lỏng BBL dùng
để tiêu độc văcxin và huyết thanh. BBL sẽ bị phá hủy thàn dạng vô hoạt
tính sau vài giờ chứ không khó loại trừ như EtO. Năng lực diệt khuẩn tuy
cao hơn EtO nhưng khả năng xuyên thấu qua vật liệu lại kém hơn so với
EtO. Hơn nữa chất này có thể gây ung thư cho nên không được ứng dụng
rộng rãi như EtO.
Gần đây
hydrogen peroxide dạng bay hơi cũng được dùng để tiêu độc các phòng thao
tác an toàn sinh học.
15.6. ĐÁNH GIÁ
HIỆU LỰC CỦA CÁC TÁC NHÂN KHÁNG VI SINH VẬT
Tại Hoa
Kỳ việc đánh giá các tác nhân kháng vi sinh vật được thực hiện bởi hai
cơ quan khác nhau: Cơ quan quản lý các chất tiêu độc bảo vệ môi trường
và Cơ quan quản lý Thực phẩm và dược phẩm. Cần đánh giá các tác nhân này
có hiệu quả kháng vi sinh vật hay không, có hiệu lực từ nồng độ nào. Sau
đó tiến hành trên từng ứng dụng thực tiễn.
Phổ biến
nhất là Thí nghiệm Hệ số phenol (phenol coefficient test), tức là so
sánh hiệu lực của một số chất tiêu độc với phenol. Đầu tiên pha loãng
với các mức độ khác nhau, sau đó cấy vào các độ pha loãng này vi khuẩn
thương hàn Salmonella typhi và tụ cầu vàng Staphylococcus aureus,
để ở 20°C hay 37°C. Sau 5 phút lại cấy sang môi
trường mới và nuôi cấy tiếp 2 ngày hay lâu hơn. Độ pha loãng cao nhất
trong 10 phút có thể diệt hết vi khuẩn được dùng để tính toán Hệ số
phenol. Lấy bội số pha loãng của chất thử nghiệm chia cho bội sô pha
loãng phenol đạt hiệu quả như nhau thì thu được Hệ số phenol. Ví dụ bội
số pha loãng của phenol là 90 mà bội số pha loãng của chất tiêu độc thử
nghiệm là 450 thì Hệ số phenol là 5. Hệ số phenol càng cao thì biểu thị
chất thử nghiêm có nang lực tiêu độc trong cùng điều kiện thí nghiệm
càng cao. Hệ số phenol càng cao hơn 1 thì biểu thị năng lực tiêu độc
càng cao hơn phenol (bảng 15.5)
Bảng 15.5: Hệ
số phenol của một số chât tiêu độc
Chất tiêu độc |
Với S.typhi* |
Với S.aureus* |
Phenol |
1 |
1 |
Cetylpyridinium chloride |
228 |
337 |
O-phenylphenol |
5,6 (20°C) |
4,0 |
p-cresol |
2,0-2,3 |
2,3 |
Hexachlorophene |
5-15 |
15-40 |
Merthiolate |
600 |
62,5 |
Mercurochrome |
2,7 |
5,3 |
Lysol |
1,9 |
3,5 |
Isopropyl alcohol
|
0,6 |
0,5 |
Etanol |
0,04 |
0,04 |
Dung dich 2%I2
trong cồn |
4,1-5,2 |
4,1-5,2 |
*Những chỗ
không chú thích là xử lý ở 37°C
Hệ số
phenol là có ích để sơ bộ lựa chọn chất tiêu độc, nhưng trong quá trình
ứng dụng thực tế không thể dùng để biểu thị hiệu lực cao thấp của chất
tiêu độc. Bởi vì hệ số phenol là số liệu thu được trong những điều kiện
thí nghiệm nhất định, với các vi sinh vật thuần chủng, còn trong thực tế
với một quần thể vi sinh vật phức tạp, có tồn tại các chất hữu cơ, chất
vô cơ, với các pH, nhiệt độ khác nhau..., hiệu lực của chất tiêu độc
chịu ảnh hưởng rất nhiều vào các nhân tố môi trường khi sử dụng.
Muốn đánh
giá thực tế hơn hiệu lực của các chất tiêu độc có thể tiến hành các
phương pháp thử nghiệm khác. Trên thực tế so sánh các chất hóa học khác
nhau để kiểm tra tốc độ diệt khuẩn. Có thể dùng Thử nghiệm pha loãng
thực dụng (use dilution test) để tiến hành xác định. Tìm nồng độ nào của
chất tiêu độc có thể diệt được 95% vi sinh vật theo mức độ tin cậy. Còn
có thể dùng phương pháp Thí nghiệm thực dụng (in-use test) trong các
điều kiện thực tế cụ thể để xác định nồng độ bắt đầu có tác dụng của
từng chất tiêu độc.
© http://vietsciences.free.frr
và http://vietsciences.org
Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà