1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI:
1.1. Nhuộm Gram
(phương pháp Hucker cải tiến)
Vật liệu, hoá chất:
·
Dung dịch Tím kết
tinh (Crystal violet):
2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95%
0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước
cất
Trộn hai dịch nói trên lại với
nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử
dụng vài tháng.
·
Dung dịch Iod:
Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm
2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước
cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối.
·
Dung dịch tẩy màu:
Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton.
·
Dung dịch nhuộm bổ
sung:
Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O
2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5
(vol/vol) để có dung dịch 0,5%.
Các bước tiến hành:
·
Chuẩn bị vết bôi:
dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch
(sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa
phiến kính, làm khô trong không khí.
·
Cố định tế bào: hơ
nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
·
Nhuộm bằng dung
dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
·
Nhuộm lại bằng dung
dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
·
Nhỏ dịch tẩy màu,
giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu),
rửa nước, thấm khô.
·
Nhuộm bổ sung bằng
dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô
trong không khí.
·
Soi kính: dùng vật
kính dầu 100´.
Kết quả:
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím,
Gram (-)
bắt màu đỏ.
 
Hình 1.1.
Các bước tiến hành nhuộm Gram và ví dụ minh hoạ kết
quả.
1.2. Nhuộm tiên mao
Vật liệu, hoá chất:
·
Dung dịch A: Acid
tannic 5 g
FeCl3 1,5
g
Formalin 2 ml
NaOH 1% 1 ml
Nước cất 100 ml
·
Dung dịch B: 2 g
AgNO3 hoà tan trong 100 ml nước cất, lấy
10 ml dể riêng. Nhỏ dung dịch NH4OH đậm
đặc vào 90 ml còn lại, thấy hình thành
tủa rất đặc, tiếp tục nhỏ NH4OH vào cho
đến khi tan hết tủa. Lấy 10ml AgNO3 đã bỏ
ra ban đầu nhỏ từ từ vào dung dịch, thấy xuất hiện
váng mỏng, tiếp tục nhỏ vào cho đến khi vừa tan hết
váng thì thôi.
·
Chuẩn bị phiến
kính: rửa thật sạch, ngâm trong cồn, đốt cháy hết
cồn rồi mới sử dụng.
Các bước tiến hành:
·
Hoạt hoá vi khuẩn
2-3 lần trước khi tiến hành nhuộm.
·
Dùng que cấy vô
trùng lấy vi khuẩn từ mặt thạch (mới cấy 18-24 giờ)
hoà vào 1 giọt nước cất đặt giữa phiến kính, để
nghiêng cho chảy về một phía, làm khô trong không
khí.
·
Cố định tế bào: hơ
nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
·
Nhỏ dịch A lên vết
bôi, giữ 10 phút, rửa bằng nước cất.
·
Dùng dịch B cho
chảy qua để loại hết nước. Nhuộm bằng dịch B trong
30-60 giây. Hơ nóng, để nguội rồi rửa lại bằng nước
cất.
·
Soi kính: dùng vật
kính dầu 100´.
Kết quả:
Tế bào vi khuẩn bắt màu nâu thẫm,
tiên mao bắt màu nâu.
 
Hình 1.2.
Ví dụ minh hoạ kết quả nhuộm tế bào vi khuẩn và tiêm
mao
1.3. Kiểm tra khả năng di động
Vật liệu, hoá chất:
·
Chuẩn bị ống nghiệm
chứa môi trường thạch bán lỏng (0,3-0,6% thạch).
Các bước tiến hành:
·
Dùng que cấy có đầu
nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường
thạch bán lỏng.
·
Đặt ống nghiệm
thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau
1-3 ngày, có khi lâu hơn.
Kết quả:
Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết
cấy tức là chúng có khả năng di động.
Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức
là chúng không có khả năng di động
Chú ý: với vi khuẩn hiếu khí chỉ
quan sát ở phần trên của vết cấy.
1.4. Nhuộm bào tử
Có hai phương pháp nhuộm
1.4.1. Nhuộm Lục Malachit (phương
pháp Schaeffer-Fulton)
Vật liệu, hoá chất:
·
Dung dịch Lục
Malachite (Malachite green) bão hoà (khoảng 7,6%)
·
Dung dịch Safranin
0,5% (xem nhuộm Gram)
Các bước tiến hành:
·
Làm vết bôi và cố
định tế bào như đối với nhuộm Gram.
·
Nhuộm bằng dung
dịch Lục Malachite trong 10 phút, rửa nước.
·
Nhuộm lại bằng dung
dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
·
Soi kính: dùng vật
kính dầu 100´
Kết quả:
Bào tử có màu lục, tế bào có màu
đỏ.
Chú ý: phân biệt bào tử với các
hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục
1.4.2. Nhuộm Carbolic Fuchsin
Vật liệu, hoá chất:
·
Dung dịch A:
10 ml dung dịch Fuchsin kiềm bão hoà trong etanol
(khoảng 10%)
100 ml dung dịch acid carbolic (phenol) 5% (trong
nước).
Trộn đều với nhau (chuẩn bị trước khi dùng)
·
Dung dịch B:
100 ml Etanol 95%
3 ml HCl đậm đặc
·
Dung dịch C:
30 ml dung dịch Xanh metylen
(Methylene blue) bão hoà trong etanol (khoảng 2%)
100 ml dung dịch KOH 0,01% trong nước.
Trộn đều với nhau, để càng lâu càng tốt.
Các bước tiến hành:
·
Làm vết bôi trên
phiến kính, cố định tế bào.
·
Nhỏ dung dịch A lên
vết bôi, hơ nóng nhẹ bên dưới để bay hơi, tránh để
sôi. Thêm dần dần thuốc nhuộm để không bị khô cạn,
giữ trong 5 phút. Đợi nguội, đổ thuốc nhuộm đi.
·
Dùng dịch B rửa cho
đến khi vừa thấy vừa hết màu đỏ, rửa nước.
·
Nhuộm lại bằng dung
dịch B trong 2-3 phút, rửa nước, thấm khô.
·
Soi kính: dùng vật
kính dầu.
Kết
quả:
Bào
tử bắt màu đỏ, tế bào bắt màu xanh
 
Hình 1.3.
Các bước tiến hành nhuộm Carbolic
Fuchsin và ví dụ minh hoạ kết quả.
1.5. Nhuộm vỏ nhầy (Capsule)
Có hai phương pháp
1.5.1. Phương pháp nhuộm âm bản
Vật liệu, hoá chất:
·
Mực tàu
·
Metanol
·
Dung dịch safranin
0,5%
Các bước tiến hành:
·
Lấy vi khuẩn hoà
vào giọt nước trên phiến kính.
·
Nhỏ thêm 1 giọt mực
tàu, trộn đều. Dùng cạnh lamen dàn mỏng vết bôi, làm
khô trong không khí.
·
Cố định vết bôi
bằng cách nhỏ metanol lên vết bôi, giữ trong 1 phút.
·
Thêm dần dần dung
dịch Safranin 0,5% lên vết bôi để rửa metanol, sau
đó giữ trong 30 giây để nhuộm lại, rửa nước, thấm
khô.
·
Soi kính: dùng vật
kính dầu 100´.
Kết quả:
Nền vi trường màu đen,
tế bào màu đỏ, vỏ nhầy màu hồng.
1.5.2. Phương pháp Đỏ Congo
Vật liệu, hoá chất:
·
Dung dịch Đỏ Congo
(Congo red) 2% trong nước
·
Dung dịch gelatin
0,01-0,1% trong nước
·
Dung dịch HCl 1%
·
Hỗn hợp 30 ml dung
dịch Xanh metylen bão hoà (khoảng 2%) trộn với 100
ml dung dịch KOH 0,01%.
Các bước tiến hành:
·
Nhỏ 1 giọt dung
dịch Đỏ Congo và 1 giọt dung dịch gelatin lên phiến
kính sạch.
·
Lấy vi khuẩn trộn
đều với 2 giọt nói trên để làm vết bôi, để khô trong
không khí
·
Nhỏ dung dịch HCl
lên để rửa, phiến kính có màu xanh.
·
Rửa bằng nước để
loại bỏ dung dịch HCl.
·
Nhuộm lại bằng Xanh
metylen trong 1 phút, rửa nước, hong khô.
·
Soi kính: dùng vật
kính dầu 100´.
Kết quả:
Nền vi trường màu xanh,
tế bào màu đỏ, vỏ nhầy không màu
1.5.3.
Phương pháp nhuộm âm bản đơn giản
(Hình 1.4):
·
Nhỏ 1 giọt Nigrosin
vào đầu một phiến kính sạch.
·
Lấy 1 vòng que cấy
vi khuẩn trộn với giọt nigrosin.
·
Lấy một phiến kính
khác để nghiêng 450 và kéo giọt nigrosin
đã trộn vi khuẩn về phía phải một chút sau đó kéo
nhẹ về phía trái để dàn mỏng thành một vết bôi. Để
khô tự nhiên (không hơ lửa).
·
Quan sát dưới kính
hiển vi sẽ thấy vỏ nhầy màu sáng nổi lên trên một
nền màu đen.
 
Hình 1.4.
Nhuộm âm bản dùng Nigrosin và ví dụ minh hoạ kết
quả.
1.5.4. Phương pháp dùng Tím kết
tinh (Crystal violet)
Vật liệu, hoá chất:
·
Dung dịch Tím kết
tinh 1% trong nước
·
Dung dịch Sulfat
đồng CuSO4 20% trong nước
Các bước tiến hành:
·
Nhỏ vài giọt dung
dịch tím kết tinh lên phiến kính sạch
·
Lấy vi khuẩn từ ống
thạch nghiêng (48 giờ) trộn với dung dịch tím kết
tinh, dùng cạnh lam kính dàn đều trên toàn bộ phiến
kính để làm vết bôi, giữ trong không khí 5-7 phút để
làm khô, không được hơ nóng.
·
Rửa vết bôi bằng
dung dịch sulfat đồng 20%, thấm khô.
·
Soi kính: dùng vật
kính dầu 100´.
Kết quả:
·
Tế bào có màu sẫm,
vỏ nhày màu nhạt ở xung quanh.
1.6. Nhuộm thành tế bào
Vật liệu, hoá chất:
·
Dung dịch acid
tannic 5%
·
Dung dịch Tím kết
tinh 0,2%
Các bước tiến hành:
·
Làm vết bôi vi
khuẩn
·
Nhuộm bằng dung
dịch acid tannic trong 5 phút, rửa nước.
·
Nhuộm bằng dung
dịch Tím kết tinh trong 3-5 phút, rửa nước, thấm
khô.
·
Soi kính: dùng vật
kính dầu 100´
Kết quả:
·
Thành tế bào bắt
màu tím, tế bào chất màu tím nhạt.
1.7. Nhuộm hạt dị nhiễm
Vật liệu, hoá chất:
·
Dung dịch A: Xanh
Toluidin (Toluidine blue) 0,15 g
Lục
malachite
0,2 g
Acid acetic
(glacial) 1 ml
Ethanol
95%
2 ml
Nước
cất
100 ml
·
Dung dịch B: Iod
(I)
2 g
Iodid kali
(IK) 3 g
Nước
cất
300 ml
Các bước tiến hành:
·
Làm vết bôi, cố
định vết bôi.
·
Nhuộm bằng dịch A
trong 5 phút, đổ đi
·
Tráng bằng dịch B,
nhuộm thêm trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
·
Soi kính: dùng vật
kính dầu 100´.
Kết quả:
Các hạt dị nhiễm có màu đen.
Các thành phần khác của tế bào
bắt màu lục hay lục nhạt
1.8. Nhuộm hạt PHB
(Poly-β-hydroxybutyric acid)
Vật liệu, hoá chất:
·
Dung dịch A: Đen
Sudan B (Sudan black B) 0,3 g
Etanol 70% 100
ml.
Trộn đều, lắc mạnh, để qua đêm mới sử dụng.
·
Dung dịch B:
Xylene
·
Dung dịch C: Dung dịch
Safranin 0,5% trong nước.
Các bước tiến hành:
·
Làm vết bôi, cố
định vết bôi.
·
Nhuộm bằng dịch A
trong 10 phút, rửa nước, thấm khô.
·
Dùng dịch B rửa
cho đến khi mất màu.
·
Nhuộm bằng dịch C
trong 1-2 phút, rửa nước, thấm khô.
·
Soi kính: dùng vật
kính dầu 100´
Kết quả:
Hạt PHB bắt màu lam đen. Tế bào và các bộ phận khác
có màu đỏ.
1.9. Nhuộm tinh thể protein (ở
Bacillus thuringiensis)
Vật liệu, hoá chất:
·
Dung dịch nhuộm:
1 ml dung dịch Fuchsin bão hoà
bão hoà (xem nhuộm carbolic fuchsin) trộn với 100 ml
dung dịch acid carbolic 5% trong nước.
Khi dùng pha loãng 10 lần.
Các bước tiến hành:
·
Làm vết bôi, cố
định vết bôi
·
Nhuộm trong 1 phút,
rửa nước, hong khô
·
Soi kính: dùng vật
kính dầu
Kết quả:
Tinh thể bắt màu đỏ. Bào tử tách rời có vòng màu đỏ
1.10. Nhuộm vi khuẩn
kháng acid
Vật liệu, hoá chất:
·
Dung dịch A:
Dung dịch Fuchsin kiềm bão hoà trong nước (»
10%) 10 ml
Dung dịch acid carbolic 5% trong
nước
100 ml
Trộn đều 2 dung dịch với nhau.
·
Dung dịch B:
Etanol 95% 100 ml
HCl đặc 3
ml
·
Dung dịch C:
Dung dịch Xanh metylen bão hoà
trong etanol (»
2%) 30 ml
Dung dịch KOH 0,01% trong
nước 100 ml
Các bước tiến hành:
·
Làm vết bôi, cố
định
·
Nhỏ dịch A lên vết
bôi, đun nhẹ dưới phiến kính cho bay hơi nhưng không
sôi. Thường xuyên bổ sung thêm dịch A để tránh khô
vết bôi. Giữ trong 5 phút. Đợi nguội, đổ dịch A đi.
·
Dùng dịch B rửa cho
đến khi thấy vừa mất màu đỏ. Rửa nước kỹ.
·
Nhuộm bằng dịch C
trong 2-3 phút, rửa nước, thấm khô.
·
Soi kính: dùng vật
kính 40´
Kết quả:
Vi khuẩn kháng acid bắt màu đỏ.
Vi khuẩn không kháng acid bắt màu
xanh.

Hình 1.5.
Ví dụ minh hoạ kết quả xác định tính kháng acid của
vi khuẩn.
2. ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ ĐẶC
ĐIỂM SINH LÝ:
2.1. Hình thái khuẩn lạc
·
Lấy 15-20ml môi
trường thạch vô trùng, để nguội đến 50 0C
rồi đổ vào đĩa Petri (thao tác vô trùng). Nếu có
nước ngưng tụ trên nắp hộp cần úp ngược xuống để vào
tủ ấm 30-37 0C để làm khô mặt thạch.
·
Lấy một vòng que
cấy gạt 3-4 lần trên mặt thạch ở một góc. Quay đĩa
thạch sang hướng khác và ria cấy từ một vạch thành
3-4 đường khác sao cho không trùng với các đường
trước. Lặp lại theo một hướng thứ ba để pha loãng
hơn nữa phần vi khuẩn dính trên que cấy. Chú ý không
nhấc tay lên và không thay đổi hướng của vòng que
cấy.
·
Đặt vào nhiệt độ
thích hợp trong 1-2 ngày để chọn ra các khuẩn lạc
mọc riêng rẽ.
·
Tiến hành quan sát
các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên
cạnh), chú ý về kích thước, hình dạng khuẩn lạc,
hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ
trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi
trường hay không)
 
Hình 2.1.
Cấy ria tế bào để tách khuẩn lạc đơn và các dạng
khuẩn lạc thường gặp.
2.2. Nhiệt độ sinh trưởng và
tính bền nhiệt
·
Lấy một vòng que
cấy sinh khối cấy vào các ống nghiệm có môi trường
dinh dưỡng thích hợp (môi trường thạch hoặc dịch
thể).
·
Đặt ở các điều kiện
nhiệt độ khác nhau (3 ống trong một nhiệt độ). Đối
với các loài ưa ấm (mesophiles), nhiệt độ sinh
trưởng và tính bền nhiệt thường được kiểm tra với
thang nhiệt độ 4, 20, 30, 37, 41, 45 và 65 0C.
Từ 37 0C trở lên có thể dùng các nồi cách
thủy ổn nhiệt.
·
Quan sát khả năng
sinh trưởng của vi khuẩn (tạo sinh khối trên môi
trường thạch, hoặc đo OD nếu thí nghiệm được tiến
hành trên môi trường dịch thể)
Đặc biệt, tính bền nhiệt cần xác
định khi phân loại các Liên cầu khuẩn, cách làm như
sau:
·
Cấy 1 giọt dịch nuôi cấy 24 giờ vào ống
nghiệm đựng môi trường dịch thể thích hợp.
·
Giữ ở nồi cách thủy 60 0C trong 30
phút sau đó đặt vào tủ ấm 35-37 0C, nuôi
trong 48 giờ.
Nếu
vi khuẩn phát triển được là có tính bền nhiệt. Dùng
chủng vi khuẩn Enterococcus faecalis làm đối
chứng dương tính. |