1.
Khái quát về các phương pháp phân loại vi
sinh vật truyền thống:
Trước đây công tác phân loại vi
sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính hình
thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng
tế bào khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh
dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng như
sắc tố tạo thành v.v..Các đặc trưng này đôi khi cũng
bộc lộ những hạn chế do các đặc tính được dùng cho
nhóm vi sinh vật này (Enterobacteriaceae)
nhưng lại không có ý nghĩa đối với nhóm khác (vi
khuẩn gram âm - gram negative bacteria). Hạn chế của
các phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều
trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một
số vi sinh vật. Từ trước đến nay, đơn vị cơ bản của
định tên vi sinh vật là loài, bao gồm nhóm các cơ
thể có mức độ tương đồng cao về các đặc điểm hình
thái.
Các phương pháp dựa trên các phản
ứng sinh hóa:
Từ những hạn chế của việc xác
định các đặc tính hình thái dẫn đến nhiều nghiên cứu
tập trung vào các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho
các vi sinh vật riêng biệt. Sự khác biệt của các
phản ứng có ý nghĩa cho phân loại các vi sinh vật.
-
API20E KIT,
nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng
khác nhau. Nói chung hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng
kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều
sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong
các trường hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm
trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác
nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi
trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai
kết quả.
-
Phân biệt bằng thực khuẩn thể:
Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với
thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm
nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực
khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ,
trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể
xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và
chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự
khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể
khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên
cứu.
Tuy nhiên, phương pháp này cũng
bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặc
tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại
thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn
lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực
khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể
rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi
cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ.
-
Phân biệt theo Typ
huyết thanh:
Đây là phương pháp được dùng khá
lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng
(ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm
quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề
mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu thế của
phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng
để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường
hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp
khá ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp
này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết
thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh
không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn
định giữa các lần lặp lại.
-
Phân biệt bằng loại hoạt chất
kháng khuẩn (Bacteriocin):
Bacteriocin bản chất là peptid
kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi
khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại
bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính
bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã
được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin.
Kết luận:
Có nhiều phương pháp truyền thống được sử dụng
trong nhiều nghiên cứu phân loại nhưng không có
phương pháp nào tỏ ra vạn năng thích hợp cho mọi đối
tượng vi sinh vật, tính chính xác chỉ có thể đạt
được khi kết hợp nhiều phương pháp khác nhau.
2. Cách tiếp cận phân loại học
với kỹ thuật sinh học phân tử:
Ngày nay những tiến bộ
trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng
hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng
vi sinh vật. Nếu như các phương pháp truyền thống
chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì
phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên
mọi đối tượng vi sinh vật.
Nói chung các phương
pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ
yếu là:
+ Phân tích acid
nucleic.
+ Phân tích protein.
+ Phân tích
lipopolysaccharid.
+ Hóa phân loại học.
Trong phần này chúng
tôi tập trung giới thiệu một số kỹ thuật phân loại
liên quan đến acid nucleic. Các phần sau chúng tôi
lần lượt giới thiệu các phương pháp liên quan đến
polysaccharid, lipoprotein và hóa phân loại.
2.1. Phân tích acid
nucleic:
Kỹ thuật phân tích acid
nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích thước,
cấu trúc acid nucleic, mối tương quan về trình tự
acid nucleic thông qua giải trình tự ADN và lai ADN.
a. Phân tích ADN
plasmid:
Phương pháp phân tích ở
đây bao gồm tách plasmid, so sánh các loại plasmid
về kích thước sau đó tinh sạch plasmid và xử lý bằng
enzym cắt hạn chế, sau đó điện di trên gel agarose
và so sánh sự đa hình của các mảnh cắt để phân biệt
các chủng vi sinh vật với nhau.
  |
Plasmid vòng |
  |
Streptomyces và Borrelia |
Plasmid là nhân tố di
truyền ngoài nhân và sao chép độc lập với nhiễm sắc
thể. Cấu trúc plasmid là sợi đôi ADN khép kín theo
vòng. Tuy nhiên, có nhiều trường hợp ngoại lệ là sợi
kép ADN mạch thẳng (đối với vi khuẩn Borrelia
và Streptomyces). Plasmid được tìm thấy hầu
hết ở các vi khuẩn và một số ít các vi sinh vật nhân
thực bậc thấp như nấm men.
+ Tách plasmid:
Thông thường lượng plasmid có trong tế bào chiếm <
5% tổng số acid nucleic của tế bào. Như vậy, ta phải
thực hiện phép tách plasmid ra khỏi ADN của nhiễm
sắc thể. Nói chung có nhiều phương pháp tách plasmid
từ vi khuẩn nhưng nguyên tắc chung là phá tế bào vi
khuẩn dùng enzym, siêu âm hay trong dung dịch kiềm
có chất tẩy rửa là SDS hoặc TritonX-100, sau đó là
việc loại ADN của nhiễm sắc thể và protein. Thông
thường dùng phương pháp kết tủa với axetat. Lúc này
phần lớn các thành phần ADN nhiễm sắc thể và protein
của tế bào đã bị kết tủa bị loại bằng li tâm và
plasmid nằm trong dịch trên tủa được tách khi kết
tủa với ethanol hay isopropanol. Đây là phương pháp
có hiệu quả để tách plasmid, trên thực tế hiệu quả
tách các plasmid có kích thước nhỏ cao hơn nhiều so
với các plasmid có kích thước lớn (>100 Kb). Với các
plasmid có kích thước lớn cần các thao tác nhẹ nhàng
để tránh đứt gãy do các nguyên nhân cơ học. Với cách
tách plasmid như trên thì sản phẩm thu được có lẫn
các đoạn ADN có kích thước khoảng 500 bp và nhiễm
ARN. Để tránh nhiễm ARN thì cần xử lý với RNase
(ribonuclease A). Tuy nhiên, có thể tách theo các
phương pháp như:
-
Tách bằng Caeseium chloride.
-
Tách bằng KIT QIAGENE.
-
Tách bằng kỹ thuật khác.
+ Điện di plasmid trên gel
agarose:
Sau khi thu được plasmid thì phải
tiến hành kiểm tra trước khi phân tích kết quả điện
di trên gel agarose để biết phổ plasmid và kích
thước của chúng. Khi tiến hành điện di thì nồng độ
gel khoảng 0.7- 1% với một trong các đệm sau: TAE
(40 mM Tris acetat 1mM EDTA, pH 8.0), TBE (89 mM
Tris borat 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0) và
TPE (80 mM Tris- phosphats 2 mM EDTA, pH 8.0). Sau
khi điện di, gel được nhuộm với ethidium bromide và
phát hiện dưới tia UV (310 nm). Nồng độ ethidium
bromide khoảng 5 mg/l và thời gian nhuộm là 10 phút.
Sau đó được rửa một lần nhanh bằng nước loại ion
trước khi được nhìn dưới UV và chụp ảnh làm tài
liệu.
Một số vấn đề cần lưu ý khi phân
tích plasmid: trên gel thông thường plasmid được
thấy ở 3 dạng: dạng siêu xoắn, dạng đứt gãy và dạng
mạch thẳng khi bị cắt bởi endonuclease. Dạng di
chuyển tốc độ cao hơn là siêu xoắn (Hình 1.1).

Hình 1.1. Di chuyển của
plasmid mạch thẳng (L) và siêu xoắn (OC) khi điện di
Đôi khi việc tách
plasmid cũng phức tạp đặc biệt trong những trường
hợp plasmid có kích thước nhỏ có lẫn các mảnh ADN
của nhiễm sắc thể. Trong mọi trường hợp đều có nhiễm
các RNA và chúng di động nhanh nhất trừ các trường
hợp plasmid như vậy không được nhầm lẫn giữa plasmid
siêu xoắn và dạng chính plasmid đứt gãy và plasmid
khác. Một chú ý khác là tránh nhầm lẫn khi so sánh
kích thước giữa các plasmid siêu xoắn và dạng duỗi
xoắn hay mạch thẳng. Thực tế là chỉ có thể so sánh
các plasmid siêu soắn với nhau về kích thước.
Khi tiến hành phân biệt
giữa các chủng vi khuẩn thì đương nhiên là chỉ có
thể thực hiện so sánh giữa các chủng cùng có plasmid
với nhau. Cũng nên chú ý là không phải các chủng đều
giống nhau về đặc tính miễn dịch nếu có chung kết
quả phân tích plasmid như nhau. Phép phân tích sẽ có
hiệu quả trong các mẫu có nhiều loại plasmid, tuy
nhiên cũng phải tính đến việc các plasmid cũng có
thể bị mất trong quá trình bảo quản.
+ Kỹ thuật dấu vân tay (finger
printing) phân tích plasmid với enzym cắt hạn chế:
Cho đến nay, người ta đã
tìm thấy hơn 400 enzym cắt hạn chế. Mục đích của kỹ
thuật này bổ sung cho kỹ thuật so sánh phổ kích
thước plasmid ở trên. Tức là người ta có thể phân
biệt được sự khác nhau của các plasmid có cùng kích
thước. Như vậy, khi xử lý plasmid với một hay kết
hợp một số enzym cắt hạn chế thì kết quả sẽ thu được
là các đoạn ADN được cắt có kích thước khác nhau.
Kết quả này có độ lặp lại cao, do đó dễ sử dụng khi
so sánh các mẫu khác nhau.
Hiện nay, có nhiều enzym
cắt hạn chế được sản xuất và tiêu thụ trên thị
trường, các enzym này có điểm nhận biết thay đổi từ
4-6 cặp nucleotid. Thông thường xử lý enzym trong 1
giờ sau đó mẫu được phát hiện trên gel agarose hoặc
polyacrylamid Tuỳ thuộc vào kích thước của các mảnh
cắt mà sử dụng agarose có nồng độ khác nhau:
Bảng 1.1. Nồng độ agarose và
kích thước mẫu ADN tương ứng.
Nồng độ agarose (%) |
Kích thước ADN
(kb) |
0.3 |
1-7 |
0.5 |
0.7-45 |
0.8 |
0.4-20 |
1.0 |
0.3-10 |
1.2 |
0.2-8 |
1.5 |
0.2-6 |
2.0 |
0.1-5 |
Theo kinh nghiệm của
nhiều tác giả (Grimont-1991) phổ các băng ADN có ý
nghĩa cho so sánh không nên dưới 10 băng và nên có
cả băng kích thước nhỏ và kích thước lớn. Tuy nhiên,
các băng lớn không nên vượt quá 10 do băng có kích
thước lớn như vậy khó di chuyển trên gel. Trong các
trường hợp so sánh thì nên dùng thang chuẩn ADN để
so sánh kích thước và phép phân tích dấu vân tay cho
các lần phân tích khác nhau. Như đã trình bày ở
trên, nếu như phân tích các chủng vi sinh vật dựa
vào kích thước plasmid có ý nghĩa đối với các đối
tượng có nhiều plasmid thì phương pháp xử lý enzym
cắt hạn chế lại có ý nghĩa lớn trong các trường hợp
nghiên cứu dịch tễ học trên các chủng có cùng phổ
plasmid hay plasmid có kích thước giống nhau. Người
ta đã ứng dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu chủng
E.coli (0157: H7) gây bệnh từ thực phẩm
(Hamburger). Các plasmid từ các chủng khác nhau thì
có phổ khác nhau về các đặc điểm cắt bởi enzym cắt
hạn chế. Kết quả tạo ra các mảnh ADN đặc trưng cho
cá thể làm cơ sở cho phép so sánh. Tuy nhiên khó có
thể so sánh kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm
khác nhau, sở dĩ như vậy là do không dùng cùng một
loại enzym cắt hạn chế. Một lý do nữa cũng cần được
đề cập đến là sự xuất hiện các đột biến ngẫu nhiên
tại vị trí enzym cắt, kết quả này tạo ra sự khác
biệt về phổ thu được từ các mảnh cắt.
b. Phân tích ADN
nhiễm sắc thể:
Phương pháp phân tích ở
đây bao gồm việc tách ADN của nhiễm sắc thể và cắt
bằng enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các vi sinh
vật với nhau. Một chú ý khi tách ADN nhiễm sắc thể
phải thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do nguyên
nhân cơ học. Nói chung các mảnh cắt nên có kích
thước nhỏ hơn hoặc bằng 50 kb. Việc tách các mảnh
cắt đó được thực hiện dựa vào kỹ thuật điện di trong
trường xung điện (PFGE =
Pulsed Field
Gel Electrophoresis
).style="text-align: justify; margin-top: 6.0pt">
Như vậy kỹ thuật dấu
vân tay không chỉ áp dụng trong trường hợp trên tế
bào mang plasmid mà kỹ thuật này còn được sử dụng
với nhiễm sắc thể cho mọi trường hợp.rường hợp.ường hợp.ường hợp.
Liên quan đến vấn đề
này phải kể đến kỹ thuật BRENDA: phân tích kết quả
xử lý enzym cắt hạn chế với vi sinh vật. Ở đây cách
chọn loại enzym cắt hạn chế vô cùng quan trọng, theo
cách chọn này có thể tạo ra quá nhiều mảnh cắt nên
không thể phân biệt được các băng riêng rẽ trong khi
đó đối với các trường hợp khác lại tạo ra quá ít
mảnh cắt có kích thước lớn khó tách theo các kỹ
thuật điện di hiện có. Các vi sinh vật khác nhau có
tỷ lệ GC khác nhau (dao động từ 25-75%) các mảnh cắt
thu được sau khi xử lý enzym cắt hạn chế rất khác
nhau. Theo Nei M. và Li W. H. (1979) thì số mảnh cắt có thể
thu được tính trên lý thuyết là:
a = (g/2)r1 x
{1-(g/2)}r2
Trong đó:
g - tỷ lệ GC của ADN
r1 - số cặp GC
r2 - số cặp AT
trong vị trí cắt của enzym giới hạn sử dụng
a - số vị trí cắt
khi sử dụng enzym cắt hạn chế.
Mặt khác, người ta cũng căn cứ
vào kết quả nghiên cứu các vị trí cắt của bộ gene vi
sinh vật làm cơ sở cho cách chọn enzym cắt. Thông
thường cho mỗi phép phân tích người ta ghi được số
các băng cắt bởi enzym và tính toán kích thước các
mảnh tạo thành làm cơ sở cho các phép phân tích về
sau. Tuy nhiên, một trong những nguyên nhân hạn chế
cho phép phân tích trên là các phương pháp tách ADN
thông thường đều dẫn đến thay đổi kích thước do đứt
gãy ADN nhiễm sắc thể, mặt khác sự có mặt của
plasmid lẫn cũng tạo ra sự khác biệt giả trong kết
quả phân tích, để khắc phục nhược điểm trên người ta
phải thực hiện phép phân tích ADN nhiễm sắc thể
nguyên vẹn để phát hiện các nguồn ADN tạp nhiễm lẫn
vào kết quả phân tích.
+ Kỹ thuật điện di
trong trường xung điện (điện di trong trường điện
thay đổi, PFGE)
- Nguyên tắc: Trước tiên
các mẫu đưa vào phân tích phải được xử lý trước bằng
loại enzym cắt hạn chế mà có rất ít điểm cắt. Kết
quả phải tạo ra được các mảnh có kích thước lớn (50
kb – 12 Mb), với kích thước này không thể điện di
theo phương pháp thông thường mà chỉ có thể tách ra
bằng kỹ thuật PFGE (ật PFGE (ật PFGE (uật PFGE (Pulsed-Field Gel
Electrophoresis ). Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên được
Schwartz va Cantor (1984) giới thiệu. Tuy nhiên sau
đó đã có nhiều tác giả mô tả lại kỹ thuật này, tuy
có sai khác ít nhiều nhưng cơ sở lý thuyết của các
phương pháp này là như nhau: Mục đích của kỹ thuật
này là tăng khả năng di động của các mảnh ADN có
kích thước lớn trong điện trường, do đó các thành
phần gel và đệm hầu như không thay đổi theo các
phương pháp điện di thông thường. Tuy nhiên theo
phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan
đến sự di động của các mảnh ADN có kích thước khác
nhau trên gel agarose trong một trường điện không
đổi. Kết quả ở đây là phân tử lớn khó di động hơn
phân tử nhỏ qua mắt xích agarose, tạo ra sự tách
biệt trong trường điện di. Trong trường hợp PFGE lực
làm thay đổi khả năng di động lại là trường điện
tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh ADN có kích
thước khác nhau thay đổi hướng di động. Như vậy kết
quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ có khả
năng di động khác nhau. Kích thước càng lớn thì mức
độ di động càng chậm. Sự di động khác nhau của ADN
chủ yếu phụ thuộc vào kích thước chứ không phải do
gel agarose như ở phương pháp điện di thông thường,
hình 1.2.

Hình 1.2. Sử dụng kỹ thuật
PFGE phân tích nhiễm sắc thể
sau khi xử lý với Sma I với 7
chủng Haemophilus ìnluenzae.
Tiếp theo các mô tả của
Schwartz va Cantor, Smith và Codemine (1990) đã đề
cập đến sự di chuyển của các mảnh ADN khác nhau là
hàm số tuyến tính với kích thước của chúng. Trên cơ
sở đó có thể điều chỉnh các xung điện và điện
trường. Tuy nhiên các nhân tố khác cũng có mối tương
tác lẫn nhau và ảnh hưởng đến khả năng di động của
ADN như: nhiệt độ, điện thế, nồng độ agarose cũng
như nồng độ ion trong đệm.
- Chuẩn bị ADN cho PFGE: Chuẩn bị
ADN từ nhiễm sắc thể không giống như các phương pháp
chuẩn bị ADN plasmid. Một vấn đề thường xảy ra là sự
đứt gãy ngẫu nhiên ADN dẫn đến sai khác trong kết
quả phân tích. Để hạn chế điều này người ta phải
thực hiện kỹ thuật tách ADN NST khỏi tế bào mẫu
agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp – LMT (Schwartz
va Cantor – 1984 và Smith, Klco 1988). Theo phương
pháp này hỗn dịch tế bào (dịch nuôi cấy hoặc dịch
huyền phù) được trộn với LMT agarose tại 37oC.
Hỗn dịch đầu tiên được xử lý với enzym và chất tẩy
rửa để tách ADN NST khỏi thành, màng tế bào, RNA và
protein. Sau đó là xử lý với EDTA, bất hoạt nuclease
tế bào với proteinase K và N-lauroylsarcosine để
loại các thành phần khác của tế bào. Kết quả là phần
LMT agarose có chứa ADN NST được dùng làm mẫu chạy
gel 0.5-1.0% (nên làm tan ở 65oC) và đưa
lên mẫu chạy gel PFGE, tài liệu của Smith (1988) mô
tả chi tiết cách chuẩn bị mẫu từ các tế bào có và
không có thành tế bào: vi khuẩn, nấm men, nấm sợi,
tế bào thực vật và động vật. Nói chung với các
trường hợp có thành tế bào thì cần đến enzym phá
thành tế bào. Lượng ADN NST thường dao động trong
khoảng 0.5-20 µg ADN là thích hợp. Nếu quá nhiều ADN
thì không thể phân tích được, còn quá ít thì cũng
không thể phát hiện được các băng ADN trong kết quả
phân tích. Mẫu ADN dùng cho kỹ thuật PFGE có thể
được giữ 1 năm trong lạnh có chứa 0.5M EDTA.
- Sau khi thu được ADN
NST trong mẫu LMT agarose thì tiến hành xử lý với
enzym giới hạn loại có ít điểm cắt. Tuy nhiên mẫu
đầu tiên phải được xử lý với PMSF để bất hoạt
protein K sau đó PMSF lại phải loại bỏ sau một số
lần rửa với chất tẩy rửa và EDTA. Sau đó chỉ cần
phân nhỏ mẫu trong agarose được xử lý với đệm và
enzym cắt hạn chế qua đêm trong tube và sau đó toàn
bộ mẫu này được sử dụng để tách trong trường xung
điện. Bảng 1.2 dưới đây liệt kê các enzym cắt hạn
chế được dùng cho phân tích PFGE.
Bảng 1.2. Một số enzym cắt hạn
chế được dùng cho kỹ thuật PFGE.
Enzym |
Vị trí cắt |
AatII |
GACGT/C |
ApaI |
GGGCC/C |
ClaI |
AT/CGAT |
MluI |
A/CGCGT |
NarI |
GG/CGCC |
NheI |
G/CTAGC |
NotI |
GC/GGCCGC |
NruI |
TCG/CGA |
PvuI |
CGAT/CG |
SacII |
CCGC/GG |
SalI |
C/TCGAC |
SfiI |
GGCC(N)4/NGGCC |
SmaI |
CCC/GGG |
XhoI |
C/TCGAG |
-
Ứng dụng
của kỹ thuật phân tích PFGE:
Kỹ thuật PFGE đã được sử dụng cho
nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau (xem bảng
1.3).
Bảng 1.3. Minh hoạ các chủng
vi sinh vật được phân tích dựa trên kết quả PFGE thu
được từ các đoạn nhiễm sắc thể.
Vi sinh vật nghiên cứu |
Tài liệu tham khảo |
1.
Acinetobacter baumannii
2.
Brucella spp
3.
Campylobacter hyointestinalis
4.
Campylobacter jejuni
5.
CADNida arabicans
6.
CADNida prapsilosis
7.
Coxiella burnettii
8.
Enterobacter cloacae
9.
Enterococcus faecium
10.
Escherichia coli
11.
Listeria monocytogenees
12.
Leptospira spp
13.
Mycobacterium tuberculosis
14.
Neisseria meningitidis
15.
Psedomonas aeruginosa
16.
Shigella spp
17.
Staphylococcus aureus
18. Streptococci ssp |
Gouby et al (1992)
Allardet, Servent et al
(19980
Salama et al (1992)
Yan et al (1991)
Vasquez et al (1991)
Carruba et al (1991)
Heizen et al (1990)
Haertl ADN BADNlow (1993)
MirADNa et al (1991)
Bohm ADN Karch (1992)
Brosch et al (1991)
Herrmann et al (1992)
Zhang et al (1992)
Bygraves ADN Maiden (1992)
Boukadida et al (1987)
Sodati ADN Piffaretti
(1991)
Prevost et al (1992)
Single ADN Martin (1992) |
Mỗi một đối tượng có đặc trưng
riêng về kết quả phân tích PFGE và được dùng cho
nghiên cứu so sánh với nhau về sự tương đồng. Đối
với nhiều đối tượng có nhiễm sắc thể thì không nhất
thiết phải thực hiện đối với mọi nhiễm sắc thể mà
chỉ cần trên một số nhiễm sắc thể mà thôi. Ví dụ
trong trường hợp của C.albicans Monod
(1990) chỉ cần thực hiện phép phân tích với một
trong 4 tổ hợp của một số nhiễm sắc thể là đủ. Cho
dù theo các cách chuẩn bị nhiễm sắc thể khác nhau
thì kết quả của phép phân tích PFGE đều giống nhau.
Phép phân tích PFGE được ứng dụng cho các nghiên cứu
ở mức độ loài với loài.
Một số điểm cần
lưu ý khi sử dụng kỹ thuật PFGE:
+ Kỹ thuật này đòi hỏi
phải có trang thiết bị chuyên dụng, kỹ thuật cũng
như kinh nghiệm vì việc tách nhiễm sắc thể đôi khi
gặp khó khăn trên một số đối tượng vi sinh vật.
+ Kỹ thuật PFGE không đủ
nhạy để phát hiện những sai khác nhỏ giữa các mẫu,
đặc biệt khi thực hiện với một enzym thì kết quả có
thể giống nhau nhưng không chắc chắn là hai mẫu
giống nhau hoàn toàn. Điều đó có nghĩa là kỹ thuật
này nên dùng để xác định sự khác nhau còn việc xác
định sự giống nhau thì không đủ tin cậy. Tuy nhiên
ngay cả khi xác định sự khác nhau đôi khi các mẫu có
plasmid nhỏ hay thực khuẩn thể cũng cần xét đến vì
chính nguồn ADN này cũng tạo ra những sai khác giả.
+ Sự khác biệt giữa các
mẫu có thể phát hiện được khi dùng các enzym cắt hạn
chế khác nhau.
Tóm tắt:
Phương pháp phân tích
plasmid là phương pháp được dùng phổ biến trong các
phòng thí nghiệm chuẩn đoán vi sinh vật. Việc kết
hợp giữa phân tích plasmid với sử dụng enzym cắt hạn
chế sẽ tạo được sự phân tích chính xác với các thông
tin đáng tin cậy đối với các mẫu phân tích. Tuy
nhiên, khi phân tích các mẫu dựa trên plasmid thì
cần lưu ý là các plasmid có thể bị mất qua các thế
hệ phân chia, dẫn đến sai lệch các kết quả nghiên
cứu. Khi thực hiện phép phân tích PFGE với các
plasmid lớn sẽ khắc phục được hạn chế của các phép
phân tích hiện tại với plasmid nhỏ như trên. Phương
pháp PFGE hiện đang được dùng rộng rãi tại các phòng
thí nghiệm vi sinh vật, áp dụng trên các đối tượng
dễ nuôi cấy có thể cho các kết quả tốt hơn nhưng hạn
chế về giá thành thiết bị cũng như yêu cầu cao về kỹ
thuật và kinh nghiệm. Mặt khác khi sử dụng các enzym
cắt hạn chế hiếm có thể sẽ khó phát hiện được mức độ
sai khác. Như vậy sự kết hợp giữa các phép phân tích
plasmid, PFGE và lai ADN sẽ cho kết quả tin cậy hơn.
2.2. Lai ADN
Nguyên tắc được tiến hành như
sau: ADN tổng số được tách ra và xử lý với enzym cắt
hạn chế (có trường hợp không cần xử lý với enzym cắt
hạn chế) sau đó điện di trên gel agarose và chuyển
lên màng lai. Mẫu dò (probe) được chuẩn bị và lai
với màng ADN ở trên. Kết quả phép lai cho biết sự
khác biệt giữa các mẫu ADN khác nhau.
Phép lai được tiến hành
ở đây dựa vào cấu trúc sợi đôi ADN từ hai sợi đơn
với các cầu liên kết hydrogene theo nguyên tắc bổ sung.
Bắt đầu là đứt gãy các liên kết hydrogene do hoá chất
(kiềm) hay biến tính nhiệt, lúc này hai sợi đơn ADN
tách nhau được gọi là trạng thái biến tính ADN
(denature). Nếu tại thời điểm này người ta cho vào
một ADN đánh dấu biến tính (mẫu dò) sau đó tạo điều
kiện hồi biến xuất hiện (renature), lúc đó sẽ cho
phép các sợi đơn của mẫu dò bắt cặp với các sợi đơn
của mẫu ADN ban đầu (target ADN). Mức độ lai sẽ phụ
thuộc vào tính đặc hiệu (sự tương đồng) giữa mẫu dò
và mẫu gốc cũng như điều kiện cho phép lai thực hiện
(nhiệt độ, nồng độ muối, pH, tỷ lện mẫu dò, kích
thước mẫu dò). Như vậy, việc chọn điều kiện chính
xác cho phép lai có ý nghĩa rất quan trọng cho tính
đặc hiệu của kết quả phép lai. Sau khi lai, bước
tiếp theo là rửa bằng đệm thích hợp để loại mẫu dò
dư và cuối cùng là phép đo bức xạ đánh dấu (tuỳ theo
phương pháp đánh dấu phóng xạ hay hoá chất phát xạ
huỳnh quang) để đánh giá mức độ tương đồng của phép
lai.
Nói tóm lại một số nhân
tố tham gia vào kết quả của phép lai là: mẫu dò ADN,
phương pháp đánh dấu ADN, mẫu ADN lai và điều kiện
tiến hành và phương pháp đánh giá kết quả phép lai.
+ Chọn mẫu dò:
Việc chọn mẫu dò có ý
nghĩa quan trọng cho phép lai. Nhìn chung các nhà
phân loại học vi sinh vật thường không trực tiếp
thiết kế mẫu dò. Về mặt này chúng tôi đưa ra một số
nội dung chủ yếu về tiêu chí chọn mẫu dò theo Stahl
và Amann (1991) như sau: Mẫu dò sẽ lai với ADN đích
(target) và không lai với các nguồn ADN khác có mặt
trong mẫu lai. Khi phân tích các mẫu vi sinh vật với
nhau thì mẫu dò nên là đoạn nucleotid đặc trưng cho
các mẫu phân tích để phân biệt với các sinh vật
khác. Tuy việc chọn mẫu dò cũng mang tính kinh
nghiệm, mẫu dò đôi khi không cần phải là toàn bộ
gene
mà chỉ là một đoạn gene mã hoá cho một đặc tính đặc
trưng cho đối tượng nghiên cứu (có thể là yếu tố
kháng nguyên bề mặt, độc tố hay một gene chức năng
nào đó trên plasmid). Với cách chọn mẫu dò có kích
thước nhỏ (14-40 bp), có thuận lợi là các mẫu dò
được tổng hợp nhân tạo và phép lai thực hiện nhanh
(dưới 30 phút) trong khi đó với các mẫu dò lớn thời
gian kéo dài hơn (khoảng 16 giờ). Hạn chế lớn nhất
đối với các mẫu dò nhỏ là khó khăn khi đánh dấu và
dẫn đến giảm tính đặc hiệu của phép lai.
Một cách thường được sử
dụng là thiết kế các mẫu dò từ các chuỗi ARN thông
tin 16S. Cách chọn có thể căn cứ vào đoạn ADN có mặt
trong các đại diện mức độ dưới loài, trong loài hay
thuộc chi nghiên cứu.
+ Các phương pháp
đánh dấu:
Các kỹ thuật đánh dấu
ADN được xem là lĩnh vực phát triển mạnh nhất trong
sinh học phân tử. Nói chung kỹ thuật đánh dấu được
chia thành kỹ thuật đánh dấu trực tiếp và gián tiếp.
Trong phương pháp trực tiếp thì phần đánh dấu để
phát hiện được gắn vào acid nucleic. Đối với phương
pháp gián tiếp thì có một phần chức năng được gắn
vào acid nucleic và phần này lại được phát hiện gián
tiếp dựa vào protein bám đặc hiệu được phát hiện
bằng kỹ thuật miễn dịch. Sau đây là chi tiết các
phương pháp đánh dấu.
·
Đánh dấu trực tiếp:
- Bảng dưới đây đưa ra các loại
cơ chất dùng cho phương pháp đánh dấu trực tiếp dựa
vào việc nhân ADN được đánh dấu lên sẽ tăng độ nhạy
so với phương pháp đánh dấu chỉ được thực hiện với
các mồi đơn lẻ. Đối với các phương pháp đánh dấu
trực tiếp thì các nhóm tạo tín hiệu được gắn trực
tiếp bằng liên kết hoá trị với nucleic của mẫu dò.
- Đánh dấu trực tiếp bao gồm 2
bước chính: tạo tín hiệu dựa vào liên kết hoá trị
của nhóm tín hiệu với mẫu dò và thực hiện phép lai
giữa mẫu nghiên cứu và mẫu dò.
Bảng 1.4. Một số cơ chất dùng
cho đánh dấu trực tiếp.
Nguồn tạo tín hiệu |
Tài liệu |
32
P
35S
Alkaline phophatase
Ethidium
Fluorescein
Horseradish peroxidase
Microperoxidase
Nitrobenzofuran
Tetramethylorhodamine |
Southern (1975)
Collins& Hunsaker (1985)
Renz&Kurz (1984)
Albarella &
ADNerson(1986)
Amman & ctv (1988)
Urdea ctv(1988)
Heller& Shneider(1983)
Draper (1984)
Amman&ctv(1990) |

Hình 1.3. Minh hoạ phương pháp
đánh dấu trực tiếp (A) và gián tiếp (B)
·
Đánh dấu gián tiếp:
Đánh dấu gián tiếp được thực hiện
theo 3 bước: thực hiện phép lai giữa mẫu dò và mẫu
ADN đích, phản ứng giữa nhóm chức năng và protein
bám đặc hiệu với nhóm chức tín hiệu thông báo
(reporter) và cuối cùng là tạo ra tín hiệu từ nhóm
chức tín hiệu.
Bảng 1.5. Liệt kê một số hệ
thống đánh dấu gián tiếp.
Nhóm chức năng bám
protein |
Nhóm tín hiệu
(reporter) |
Tài liệu dẫn |
Biotin-dUTP/steptavidin
Digoxigenein-dUTP/antidigoxigenein
Sulphone/antisulphone
Dinitrophenyl/antinitrophenyl
Poly(dA)/poly(dT)
Acetyllaminofluorene/anti-acetylaminofluorene |
Alkaline phosphatase
Alkaline phosphatase
Europium chelate
Piruvate kinase
Horseradish
peroxidase
Alkaline phosphatase |
Leary et al (1982)
Kessler et al (1990)
Syvanen et al (1986)
Leller et al (1990)
Morrisey & Collins
(1989)
Tchen et al (1984) |
Mặc dù có nhiều hệ thống đánh dấu
và phát hiện tín hiệu nhưng kinh nghiệm cho thấy hệ
thống biotin và digoxidenin cho độ nhạy cao hơn cả.
Hai hệ thống này có thể phát hiện tới mức dưới
picrogam acid nucleic. Trong trường hợp với biotin
thì đôi khi có mức độ nhiễu nền cao do biotin có mặt
trong các sinh phẩm, còn đối với digoxigenein thì có
thể không gặp khó khăn này.
+ Đánh dấu phóng xạ và ghi phóng
xạ:
Phương pháp đánh dấu
phóng xạ là phương pháp được dùng phổ biến trong các
phòng thí nghiệm lai ADN với các thành phần đánh dấu
là 32P và 35S. Kết quả của
phép lai giữa mẫu dò và ADN đích được phát hiện trên
X-phim hoặc nhấp nháy lỏng. Ưu điểm nổi bật của
phương pháp đánh dấu phóng xạ là độ nhạy có thể đạt
tới dưới mức picrogam ADN đích. Hạn chế của phương
pháp này là không đạt được sự thích hợp cần thiết
cho các thí nghiệm chẩn đoán liên quan tới xác định
mẫu vi sinh vật, ví dụ thời gian bán huỷ mẫu dò
ngắn, nguy hiểm cho người sử dụng và cần yêu cầu an
toàn nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm và cá nhân sử
dụng cũng như việc quản lý chất thải.
Xuất phát từ thực tế
trên mà càng ngày người ta càng quan tâm đến các
phương pháp đánh dấu phi phóng xạ. Mục tiêu là đạt
được một hệ thống đánh dấu có độ nhạy tương đương
với phương pháp dùng chất phóng xạ. Bảng dưới đây
liệt kê các yêu cầu lý tưởng cho phương pháp đánh
dấu mẫu dò:
1, Dễ gắn với acid
nucleic theo phương pháp đơn giản và có độ lặp lại
cao.
2, Bền trong điều kiện
lai và bảo quản.
3, Không bị ảnh hưởng và
làm ảnh hưởng đến phản ứng lai.
4, Có thể thực hiện với
điều kiện phản ứng lai trong dịch thể (liquid phase)
hay có chất mang (solid phase).
5, Phương pháp phát hiện
nhạy và đơn giản.
6, Dễ bị loại bỏ sau
phản ứng lai.
7, Dễ phân biệt giữa mẫu
lai và mẫu chưa lai trong cùng điều kiện.
8, Có thể ứng dụng với
hệ thống tự động hoá.
Tuy nhiên, nếu theo các
yêu cầu lý tưởng trên thì chưa có hệ thống đánh dấu
phi phóng xạ nào thoả mãn.
Hiện nay, có nhiều hệ
thống đánh dấu phi phóng xạ đạt độ nhạy cao và đó là
lý do các phương pháp này đang được ứng dụng rộng
rãi đặc biệt là phương pháp dựa trên các enzym như
Alkaline phosphatase, Horseradisk peroxidase. Tuy
nhiên phương pháp sử dụng các chất phóng xạ hiện tại
vẫn đang được dùng cho một số phòng thí nghiệm đặc
biệt.
·
Chiến lược đánh dấu với chất phi phóng xạ.
Có 3 phương pháp đánh
dấu phi phóng xạ:
1, Dùng cơ chất hoá phát
xạ và sinh phát xạ, trong trường hợp này thì cả cơ
chất hoá và sinh phát quang đều tạo ra các bức xạ
ánh sáng và sau đó là phương pháp phát hiện bức xạ
này.
* Với nguồn cơ chất hoá
phát quang có loại như AMPPD (Bronstein, Edward &
Voyta, 1989) có thể được dùng trực tiếp như là cơ
chất cho enzym Alkaline phosphatase trong phép lai
ADN đạt độ nhạy cao trong thời gian ngắn (Bronstein
et al., 1990).
* Phương pháp phát xạ sử
dụng enzym Alkaline phosphatase trên cơ sở giải
phóng D-luciferin từ cơ chất, ví dụ
D-luciferin-O-phosphate (Miska và Geiger., 1987).
Hai phương pháp này tương đối nhạy và đang được sử
dụng rộng rãi.
2, Phương pháp phát hiện
dựa vào thay đổi màu:
Phương pháp đo màu có
thể thực hiện trên môi trường dịch thể hay chất mang
và khá nhạy so với phương pháp phát quang. Người ta
đã tạo ra các cơ chất sinh màu khi có mặt enzym
(chẳng hạn như Alkaline phosphatase). Lợi thế của
phương pháp này là việc phát hiện đơn giản do kết
quả là sự thay đổi màu dễ phát hiện và ứng dụng
trong các phòng thí nghiệm vi sinh vật.
Một phương pháp có thể
làm tăng độ nhạy của phản ứng màu bằng cách thêm một
enzym kích hoạt phản ứng màu vào hệ thống. Một ví dụ
cho điều này là vai trò loại nhóm phosphat của phân
tử NADP thành NAD do Alkaline phosphatase trong hệ
thống phát hiện mẫu dò nucleic. Trong hệ thống này
thì NAD có vai trò kích hoạt chu trình oxy hoá mà có
sự tham gia của alcohol dehydrogenease và diaphorase.
Trong mỗi một chu trình thì NAD sẽ bị khử thành
NADPH + H+. Phản ứng oxy hoá này lại kèm
theo phản ứng oxy hoá mà NADPH + H+ lại
bị oxy hoá thành NAD, mọi phản ứng xảy ra gắn liền
với việc khử ρ-indonitro-tetrazolium màu tím thành
formazan. Sản phẩm cuối cùng formazan được định
lượng bằng phép so màu (Self. 1985).
3, Cơ chất huỳnh quang
và phát xạ huỳnh quang theo thời gian.
Sử dụng cơ chất phát xạ
huỳnh quang là phương pháp khá nhạy và có thể phát
hiện được tới một phân tử chất phát xạ
(fluorescein). Nói chung với các mẫu sinh phẩm
thường có mức độ nhiễu tín hiệu nền cao. Thực tế này
có thể được cải thiện với cơ chất fluorophore bền bị
kích hoạt bởi sóng ánh sáng. Sự phát xạ sau đó được
ghi lại khi các bức xạ nền đã bị giảm. Đối với
phương pháp dùng Alkaline phosphatase thì việc phát
hiện nhân tố gắn lanthanide theo thời gian đi kèm
với hoạt tính enzym này gọi là phương pháp phát
quang lanthanide khuyếch đại bởi enzym (EALL:
Evangelista, Pollack & Templeton, 1991). Trong
trường hợp này, cơ chất không có khả hình thành phức
hệ gắn với lathanide phát xạ. Dưới tác dụng của
Alkaline phosphatase thì cơ chất và lanthalide bị
chuyển thành phức hệ hoạt động. Phương pháp này khá
nhạy nhưng hạn chế lớn nhất của nó là cần thiết bị
kích hoạt và đo bức xạ huỳnh quang.
+ Quá trình lai:
Nói chung quá trình lai
(Hybridization
)
được tiến hành theo một trong 3 cách sau để định
danh hay xác định vi sinh vật: Lai với vi sinh vật
(in situ), lai trong dịch thể và lai với chất mang
(solid support).
a.
Kỹ thuật lai với vi sinh vật
(in situ), hình 1.4.

Hình 1.4. Minh hoạ kỹ thuật
lai in situ với kỹ thuật FISH (fluorescence in situ
hybridization) phát hiện vi khuẩn Helicobacter
pylori.
Kỹ thuật này được thực hiện để
định vị chuỗi acid nucleic trong vi sinh vật sau khi
đã được cố định trong các tiêu bản hiển vi. Tuy
nhiên, do hầu hết các vi sinh vật có khả năng thấm
(hay cho phép) các đoạn ngắn oligonucleotid đánh dấu
đi vào tế bào sau khi cố định mẫu vì vậy khi sử dụng
mẫu dò đánh dấu với chất nhuộm huỳnh quang đặc biệt
có thể nhìn thấy được trực tiếp vi sinh vật dưới
kính hiển vi huỳnh quang. Điều đáng chú ý là phản
ứng lai phải tiến hành trong thiết bị được hàn kín
nhằm hạn chế việc bay hơi của dịch lai. Việc bay hơi
dịch lai này dẫn đến việc bám không đặc hiệu của
chất nhuộm huỳnh quang với tế bào. Nhiệt độ lai phụ
thuộc vào oligonucleotid mẫu dò. Sau phản ứng lai
thì mẫu phải được xem ngay hoặc được bảo quản trong
tối trong thời gian 6 tháng. Nếu mẫu dò đặc hiệu cho
RNA thì độ nhạy tăng lên rất lớn vì có tới hàng ngàn
bản copy của RNA trong mỗi tế bào (Stahl và Amman,
1991).
Lai trong môi trường
dịch thể:
Phản ứng lai trong môi
trường dịch thể xảy ra nhanh hơn nhiều so với môi
trường có chất mang pha rắn (soild). Do cả phân tử
ADN đích và mẫu dò đều có thể di động tự do trong
môi trường do đó phản ứng đạt kết quả cao nhất. Nói
chung với phép lai thực hiện trong dịch thể thì thời
gian kết thúc nhanh hơn từ 5-10 lần so với trong
điều kiện là chất mang (Bryan, et al., 1986). Tuy
nhiên, cũng có thể bổ sung thêm chất mang làm tăng
phản ứng lai. Cần thêm bước cuối cùng là tách phức
hợp mẫu dò-sợi ADN đích. Hạn chế ở đây là mẫu trong
dịch cho nên có thể tạo lên các nền kém đặc hiệu, do
vậy cần các giải pháp làm hạn chế mức độ nhiễu của
nền cho thích hợp.

Hình 1.5. Minh hoạ kỹ thuật
lai trong môi trường dịch thể.
Trên thực tế hầu hết các KIT
thương phẩm dùng cho vi sinh vật đều tiến hành trong
môi trường dịch thể. Vi sinh vật trong mẫu đầu tiên
được phân giải trong điều kiện thích hợp để ADN đích
lai với mẫu dò. Sau đó là bước lai và tách phức hệ
mẫu dò và ADN đích dựa vào các thông số của phép lai
theo kiểu kẹp díp cụ thể. Các phép lai theo kiểu kẹp
díp (hình 1.9) cần có hai đoạn ADN có trình tự khác
nhau; một đoạn để bám giữ ADN đích gắn vào chất mang
và một đoạn là mẫu dò. Điều quan trọng là hai đoạn
ADN này phải có trình tự khác nhau cho dù chúng đều
gắn với hai vùng khác nhau trên đoạn ADN đích theo
nguyên tắc bổ sung. Mẫu dò đánh dấu được bổ sung vào
trong dung dịch có các đoạn ADN đích nghiên cứu. Như
vậy theo hình vẽ phức hợp ADN mẫu dò đánh dấu để
phát hiện gắn với ADN đích và phức hợp mẫu dò- ADN
đích gắn vào chất mang đã được hình thành. Phức hợp
này được tách ra khỏi dung dịch và khi có mặt cơ
chất thích hợp để phát hiện được mẫu dò đánh dấu.
Khi dùng hệ thống phát hiện dựa vào các hoá chất
huỳnh quang hay tạo màu có thể dùng thiết bị phát
hiện kết quả một cách tự động.
+ Kỹ thuật lai dựa
vào màng:
Tác giả đầu tiên giới
thiệu kỹ thuật cố định ADN trên màng là Nygaard và
Hall (1963, 1964). Sau đó chính Southern (1975) là
người mô tả việc tách ADN khỏi gel sau khi điện di
và chuyển chúng lên màng nitrocellulose. Các đoạn
ADN đích được phát hiện bằng kỹ thuật lai và đây là
bước tiến quan trọng của sinh học phân tử. Từ năm
1977 đến nay đã có nhiều cải tiến về phép lai cũng
như bước chuyển ADN lên màng của các tác giả khác
nhau như: Meinkoth và Wahl (1984). Người ta cũng đã
sử dụng một số màng nynol, màng nitrocellulose hoạt
hoá hay có độ bền cho các phép lai. Đối với công
việc định loại vi sinh vật với kỹ thuật cố định trên
màng cho phép lai ADN thì cần chấm mẫu (là ADN sạch,
hay tế bào vi sinh vật hoặc sinh phẩm có vi sinh vật
nghiên cứu) lên màng thích hợp. Mẫu được ly giải và
ADN bị biến tính, sau đó ADN được cố định trên màng
khi đưa vào tủ xấy tại 80oC trong 2 giờ
hoặc đưa vào xử lý với tia UV trong trường hợp sử
dụng màng lynon. Mẫu dò đánh dấu sau đó được đưa vào
dung dịch. Bước tiền lai được thực hiện để hạn chế
các mẫu bám vào nhau không đặc hiệu. Sau đó là bước
lai, màng sau khi lai được rửa để loại các mẫu dò
còn dư. Bước rửa tiếp theo để đánh giá mức độ bám
đặc hiệu của phép lai. Sau đó các mẫu dò đánh dấu
lai với vị trí ADN mẫu trên màng được phát hiện bằng
các hệ thống phát hiện tương thích. Toàn bộ quá
trình lai trên màng đã được Meinkoth và Wahl (1984)
mô tả chi tiết.
Khi phát hiện typ vi
sinh vật, chúng ta phải sử dụng kỹ thuật Southern.
Trong phương pháp này ADN của nhiễm sắc thể được
tinh sạch và được xử lý với enzym cắt hạn chế thích
hợp, sau đó mẫu lại được điện di trên gel agarose và
tạo ra dấu vân (finger print) của nhiễm sắc thể. Sau
khi điện di gel được đặt dưới màng nitrocellulose
hay màng nylon nằm giữa một số lớp giấy. Lớp giấy
lọc phía trên được đặt trên cùng phần gel và màng
kẹp giữa giấy lọc như trong hình 1.6.

Hình 1.6. Mô tả phương pháp
chuyển ADN lên màng cho kỹ thuật Southern Blot.
Kết quả là đệm từ phía dưới được
thấm một cách tự nhiên lên trên. Điều đó giúp cho
việc chuyển các mảnh ADN từ gel lên màng và bám chặt
vào màng với kích thước và phiên bản đúng như trên
gel sau khi điện di (mô tả chi tiết theo Sambrook
1989).
Phương pháp truyền thống này cũng
được cải tiến khi dùng màng nylon để chuyển ADN
trong điều kiện biến tính (Read và Mann 1985). Thời
gian chuyển có thể vài giờ hoặc qua đêm. Việc cố
định ADN trên màng được thực hiện sau đó bằng cách
xử lý nhiệt hay tia UV như đã trình bày ở trên. Tuy
nhiên, nhiều phương pháp cải tiến được thực hiện
nhanh như chuyển bằng điện di (Bittner, Kupfere,
Morris, 1980) hay sử dụng bơm chân không (Medveczky,
1987; Olszewsk, 1988).
Trong nhiều trường hợp dùng điện
để chuyển ADN từ gel agarose lên màng thì trước tiên
gel phải được xử lý biến tính và được làm trung hoà
trở lại. Gel được đặt giữa hai bản điện có các bản
giấy thấm (hình 1.7).
Hình 1.7. Minh hoạ bước chuyển
ADN lên màng.
Sau đó nguồn điện được
nối và lúc đó ADN sẽ được chuyển lên màng. Thời gian
chuyển sẽ phụ thuộc vào kích thước đoạn ADN nhưng
thường dao động trong khoảng 1-3 giờ. Phương pháp có
thể thực hiện theo chiều thẳng đứng hay chiều nằm
ngang. Hiện nay có một số thiết bị bán trên thị
trường được dùng cho kỹ thuật này. Với thiết bị nằm
thẳng đứng, thì toàn bộ được ngâm trong đệm và có
thể tăng cường độ dòng điện (chú ý vì có thể làm
tăng nhiệt độ), phương pháp này cần dùng nhiều đệm.
Ngược lại theo phương pháp nằm ngang hay phương pháp
semi-dry, ở đây gel và màng được kẹp giữa các bản
giấy lọc đã tẩm ướt bằng đệm thích hợp. Trường hợp
này cần rất ít đệm và cường độ dòng điện là 1mA/cm2
là thích hợp.
Trong trường hợp chuyển
ADN lên màng bằng áp lực do chân không, việc thiết
lập hệ thống được trình bày mà ở đó gel được đặt
trên màng và sử dụng lực hút chân không để đưa ADN
lên màng. Dùng lực hút chân không đạt được hiệu quả
chuyển ADN lên màng cao hơn phương pháp thấm tự
nhiên. Hiệu quả tối đa cho chuyển gel với trường hợp
geneom sau xử lý enzym cắt hạn chế có thể đạt được
sau 1 giờ.
+ Phân tích RELPs
với kỹ thuật lai ADN.
Giới thiệu phương pháp:
Như đã trình bày, sự
phức tạp trong kỹ thuật RELP đã tạo ra những khó
khăn cho việc xác định các tác nhân gây bệnh trong
các nghiên cứu về dịch tễ học. Điều này còn khó khăn
và phức tạp hơn trong khi so sánh các kết quả thu
được trên các bản gel khác nhau hoặc tại các phòng
thí nghiệm khác nhau. Nguyên nhân là do số lượng các
băng ADN lớn tới mức không thể xác định kích thước
của chúng hay các băng thu được không lặp lại các
kết quả nghiên cứu.
Mặc dù vậy, theo phương
pháp này các phổ ADN phức tạp sau khi xử lý với
enzym cắt hạn chế sẽ được làm biến tính và chuyển
lên màng nitroxenluloza hay nylon. Màng sẽ được lai
với mẫu dò thích hợp, kết quả phổ phép lai sẽ rõ và
không quá phức tạp do nó chỉ hiển thị các mảnh ADN
bắt cặp với mẫu dò. Với một số lượng không lớn các
mảnh hiển thị thu được sau phép lai sẽ cho phép xác
định được chính xác hơn về kích thước. Điều này làm
cơ sở cho so sánh giữa các gel với nhau cũng như kết
quả thu được từ các phòng thí nghiệm khác nhau.
Khi sử dụng phương pháp
này cần chú ý một số mẫu dò sau:
1, Mẫu dò có thể là đoạn
RNA ribosom từ một loài sinh vật nào đó: ví dụ rRNA
của E.coli có thể được các công ty thương
phẩm cung cấp (Boeringer Mannheim), đây là mẫu dò
khá thuận lợi và được đánh dấu phóng xạ hay với các
cơ chất huỳnh quang. Ưu điểm chính của mẫu dò này ở
chỗ phần RNA là đoạn khá bảo thủ do đó mẫu dò có thể
dùng lai với các sản phẩm xử lý enzym cắt hạn chế
của nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Có một số loài
khi lai với mẫu dò chỉ cho một kết quả giống nhau
trong khi đó ở loài khác khi lai các chủng với mẫu
dò thì lại thu được kết quả khác nhau. Đây là cơ sở
cho phương pháp ribotyping.
2, Mẫu dò có thể là đoạn
ADN ngẫu nhiên có chức năng không xác định (Tompkins
et al., 1986). Mẫu dò này thường được dùng cho các
loài có chứa chính các đoạn ADN này. Sử dụng các mẫu
dò này đôi khi rất có ý nghĩa trong việc phân biệt
các mẫu sau khi tiến hành phương pháp ribotyping
(Saunders et al., 1990).
3. Một cách khác nữa
cũng được dùng là sử dụng mẫu dò là một đoạn ADN
tách dòng từ một gene đã biết. Ví dụ dùng đoạn gene mã
hoá cho độc tố ngoại bào (exotoxinA) sử dụng để định
typ Pseudomonas aeruginosa (Ogle et
al., 1987). Mẫu dò dùng gene mã hoá cho độc tố
Cholera được dùng để xác định các typ cho các chủng
thuộc họ phảy khuẩn sinh độc tố (Yam, Li Lung & Ng,
1989). Việc sử dụng bất kỳ loại mẫu dò nào cũng tạo
ra phổ đặc trưng của phép lai có ý nghĩa cho so sánh
giữa các chủng với nhau.
Hạn chế chính của kỹ
thuật này ở chỗ kết quả thu nhận chỉ khu trú phần
gene bắt cặp với mẫu dò mà không đặc trưng cho cả hệ
gene.
Bảng 1.6. Kết quả thu được khi
thực hiện kỹ thuật RFLP với dùng các mẫu dò không
phải là ribosom.
Đối tượng |
Tác giả nghiên cứu và tài
liệu dẫn |
Aeromonas spp |
Altwegg an
Luthyhottenstein (1991) |
Borrelia burgorferi |
Wallich et al (1992) |
Candida albicans |
Schmid et al (1992) |
Chlamydia trachomatis |
Scieux et al (1992) |
Corynebacterium
diphtheriae |
Groman et al (1993) |
Cryptococcus noeformans |
Spitzer (1992) |
Escherichia coli |
Bohm ADN Karch (1992) |
Hemophilus influenzae |
Forbes et al (1992) |
Histoplasma capsulatum |
Leathet al (1992) |
Lactobacillus helveticus |
Delostreyesgavilan et al
(1992) |
Mycobacterium
tuberculosis |
Mazurek et al (1991) |
Pseudomonas aeruginosa |
Tompkins(1991) |
Salmonella spp |
Sodati ADN Piffaretti
(1991) |
Staphylococcus aureus |
Goh et al (1992) |
- Kỹ thuật
ribotyping:
Như đã trình bày ở trên
mọi mẫu dò đều cho các kết quả có sức thuyết phục
tuy nhiên kỹ thuật dùng mẫu dò là đoạn RNA của
ribosom đã đưa ra một cách tiếp cận mới trong nghiên
cứu dịch tễ phân tử với các vi khuẩn có sự khác biệt
lớn trong khi đó các mẫu dò khác chỉ giới hạn với
một loài hay chỉ có ý nghĩa cho các chủng trong cùng
một loài. Kỹ thuật này lần đầu tiên được Grimont mô
tả năm 1986 và nhanh chóng trở thành phương pháp hữu
hiệu hiện nay cho nghiên cứu dịch tễ học vi sinh vật
ở mức độ phân tử.
Tính hợp lý cho việc sử
dụng kỹ thuật này là ở chỗ gene mã hoá cho RNA
ribosom có độ bảo thủ cao. Cũng có thể phát hiện
thấy những thay đổi chút ít trong quá trình tiến hoá
đối với các chuỗi ADN trong các vi khuẩn nghiên cứu.
Gene RNA ribosom được tổ chức thành các operon mà các
gene riêng rẽ mã cho các RNA kích thước 5S, 16S và
23S chúng được cách nhau bằng các đoạn ADN spacer
không mã cho gene nào. Nếu dùng mẫu dò hỗn hợp giữa
16S và 23S thì kết quả phép lai sẽ hiển thị các mảnh
tương ứng với phần của gene này trong khi dùng mẫu dò
là đoạn của các gene đã được tách dòng có thể đưa đến
kết quả hiển thị cả phần gene tương đồng và chuỗi
spacer. Như vậy sự khác nhau của kết quả phụ thuộc
vào loại mẫu dò sử dụng.
-
Yêu cầu kỹ thuật:
Để thu được kết quả tối ưu cần có các yêu
cầu kỹ thuật cụ thể cho từng bước thực hiện.
Đầu tiên là phải tạo ra được phổ
dấu vân tay thu được sau khi xử lý mẫu với enzym cắt
hạn chế. Phổ vân tay tối ưu khi các mảnh cắt phải
được tách rõ và phân bố đồng đều về kích thước trên
gel. Số lượng các mảnh ADN thu được phụ thuộc vào
mẫu ADN và loại enzym cắt hạn chế được sử dụng.
Thông thường phải chọn một số mẫu xử lý thử trước
với từng loại enzym (hay đồng thời xử lý với một số
enzym). Có thể thấy rõ là các enzym có 5 nucleotid
tại vị trí cắt sẽ tạo ra sản phẩm nhiều mảnh hơn các
enzym có 6 nucleotid tại vị trí nhận biết.
Thực tế cũng cho thấy khi dùng
enzym cắt hạn chế (một hay đồng thời vài loại) để
thu được phổ các đoạn cắt hợp lý cho việc phân tích
ribotyping thì các kết quả này cũng rất khác nhau.
Như vậy, điều quan trọng nên tiến hành trước các
phép phân tích này, phải chọn được một số chủng đặc
trưng và thử với một số enzym cắt hạn chế để chọn
giải pháp cho nghiên cứu dịch tễ học với kỹ thuật
này. Trong một số trường hợp kết quả phân tích khi
chỉ tiến hành với 1 hay 2 enzym cắt hạn chế có thể
không đưa ra được kết quả chính xác.
Như vậy, khi có được kết quả hợp
lý sau khi xử lý các mẫu ADN với enzym cắt hạn chế
thì tiến hành các bước chuyển các đoạn ADN trên gel
lên màng theo các phương pháp đã được mô tả ở trên.
Phương pháp chuyển bằng chân không là hợp lý hơn cả
vì kết quả cho việc chuyển các băng có kích thước
gần nhau lại được tách ra sắc nét trên màng. Khi
thực hiện phép lai nên chú ý nếu như dùng nguồn ARN
ribosom của một chủng nào đó đánh dấu làm mẫu dò thì
cần phải thay đổi điều kiện lai như nhiệt độ để phép
lai được thực hiện tốt với các đoạn ADN từ các chủng
vi sinh vật khác nhau.
Có một số phương pháp đánh dấu
mẫu dò là ADN ribosom. Phương pháp đánh dấu phóng xạ
(Grimont, 1986), đây là phương pháp có ưu thế là chỉ
cần vài bước đơn giản cho phép lai và rửa mẫu nhưng
lại mang nhiều hạn chế như: thời gian bán huỷ ngắn,
yêu cầu an toàn cho phòng thí nghiệm riêng biệt,
nguy hiểm cho người dùng và gặp khó khăn với việc xử
lý chất thải phóng xạ. Mới đây có một số phương pháp
đánh dấu mẫu dò phi phóng xạ được sử dụng khá thành
công. Pitcher (1987) đã mô tả phương pháp tổng hợp
mẫu dò gắn với bilatin để phát hiện ARN ribosom của
Providencia stuartii.
Chất kích hoạt quang hoá đã được Koblavi và Grimont
mô tả (1990). ARN ribosom cũng được đánh dấu bằng
acetylaminofluorence (AAF) do Grimont (1989) mô tả.
Công ty Eurogeneetik (Bỉ) đã cung cấp phức hợp
AAF-rARN trên thị trường.
Gần đây Gustafero và Persing (1992)
đã đưa ra một phương pháp mới mà ở đây phức hợp
horseradisk-peroxysase-polyethyleneimine với rARN và
kích hoạt bằng quang hoá. Các mẫu dò được đánh dấu
bằng các chất phi phóng xạ này có thể cho kết quả
nhanh tương đương với trường hợp dùng các chất phóng
xạ. Như vậy kết quả tiến hành phép lai các mẫu của
các chủng khác nhau trong cùng gel chuyển lên có thể
so sánh với nhau khi dùng kỹ thuật này. Trong trường
hợp xác định chính xác kết quả các mảnh lai với mẫu
dò có thể tiến hành so sánh các kết quả thu được từ
các phòng thí nghiệm khác nhau.
+ Ứng dụng kỹ thuật ribotyping:
Xác định typ vi khuẩn bằng kỹ thuật
ribotyping có một số ưu điểm so với một số kỹ thuật
định typ khác ở chỗ:
Thực tế là các gene của ribosom khá
bền do chúng nằm trên nhiễm sắc thể. Hầu hết các vi
sinh vật đều chứa nhiều phiên bản của operon ribosom
do đó khi lai với mẫu dò thích hợp thì kết quả là
tạo ra một số mảnh lai có kích thước khác nhau. Hiện
nay, nguồn rARN của E.coli đánh dấu là mẫu dò
khá phổ biến đã được thương mại hoá.

Hình 1.8. Kết quả ribotyping với
Helicobacter pylori.
Do tính đa dạng và phức tạp của kỹ
thuật định typ theo ribosom do đó trên thực tế khi
nhìn kết quả bằng mắt thường khó có thể phát hiện
được sự khác nhau hay giống nhau giữa các chủng
trong cùng một loài khi tiến hành nghiên cứu dịch tễ
học trên diện rộng. Owen và cộng sự (1992) đã nghiên
cứu khả năng trợ giúp của computer để so sánh kết
quả thu được khi nghiên cứu các chủng
Helicobacter pylori. Tương tự như vậy
Bialkowska-Hobranska và cộng sự (1990) dùng thiết bị
laze đo mật độ các mảnh ADN lai cùng với sự trợ giúp
của computer để phân tích các kết quả thu được từ
các chủng cầu khuẩn nha bào gram âm. Phương pháp này
có thể đưa ra số liệu chung làm cơ sở cho xác định
sự giống nhau giữa các loài khác nhau. Các phân tích
thu được từ các số liệu của các các thể khác nhau có
thể chỉ ra được các cá thể mới làm cơ sở cho định
danh cũng như theo dõi.
Mọi nghiên cứu cho thấy một điều
quan trọng và có ý nghĩa nhất là cách chọn enzym cắt
hạn chế và loại mẫu dò dùng cho phép lai (Saunder và
cộng sự 1991).
Tóm tắt:
Nhìn chung phương pháp
lai ADN chứng tỏ ưu thế của nó như là một kỹ thuật
quan trọng cho định typ và nghiên cứu dịch tễ học
nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Về nguyên tắc
phương pháp này cũng có ưu điểm và nhược điểm của
nó.
Ưu điểm:
-
Sử dụng cho nhiều đối tượng vi sinh vật.
-
Có các mẫu dò vạn năng được bán rộng rãi trên
thị trường. Kết quả lai có độ lặp lại cao và khá đơn
giản cho việc phân tích kết quả.
-
Có thể sử dụng sự trợ giúp của computer để
lưu giữ và phân tích kết quả thí nghiệm.
Hạn chế:
-
Phương pháp sử dụng khá phức tạp và tốn thời
gian.
-
Thông tin kết quả chỉ phản ánh cho đoạn gene
lai với mẫu dò sử dụng. Hiện nay, có thể sử dụng các
đoạn ADN tổng hợp làm mẫu dò và điều này thực tế đã
làm cải thiện nhiều mặt của kỹ thuật lai như: khi có
ADN tổng hợp thì không phải thực hiện các kỹ thuật
tách và tinh sạch các mảnh ADN tách dòng có thể lẫn
ADN plasmid. Mặt khác khi lai với mẫu dò tổng hợp
thì phản ứng tiến hành nhanh với độ đặc hiệu cao
hơn.
Cho dù kỹ thuật này được sử dụng tốt
cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau nhưng năm
1992 Heimberger và cộng sự đã tiến hành phân tích
ADN được xử lý với enzym cắt hạn chế trong trường
xung điện (PFGE), kết quả này rất có ý nghĩa cho
phép phân tích sâu hơn và phân biệt các chủng vi
sinh vật liên quan đến sự bùng phát dịch đối với các
chủng vi sinh vật khác.
Ribotyping và PFGE có chung nguyên
tắc dựa vào sự phân bố của các vị trí enzym cắt hạn
chế trên ADN của ribosom. Tuy nhiên, sự khác biệt ở
chỗ ribotyping phản ánh sự phân bố của vị trí các
enzym cắt hạn chế nằm trong các gene mã hoá cho rRNA
hay nằm trong vùng nhiễm sắc thể có độ bảo thủ cao,
còn đối với PFGE phản ánh sự phân bố của các enzym
cắt hạn chế phân bố trên toàn bộ gene nghiên cứu.
Nghiên cứu của Prevost (1992) cho thấy là kỹ thuật
PFGE có thể hiệu quả hơn kỹ thuật ribotyping đối với
phép phân tích các chủng Staphylococus aureus
kháng methicillin.
2.3. Nhân gene và kỹ thuật giải
trình tự ADN.
Kỹ thuật lai ADN đã được sử
dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của
nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn ADN đích đôi khi
chỉ có số lượng ít trừ khi các tiến hành nuôi cấy vi
sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy
không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật
hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời
gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ ADN cho các
kỹ thuật lai hay định typ. Khó khăn này được khắc
phục bằng cách làm tăng nguồn ADN đích một cách
nhanh chóng bằng kỹ thuật nhân gene PCR.
a. Kỹ thuật nhân
gene PCR (Polymerase
Chain Reaction)
Việc nhân ADN cho phép làm
tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơn nữa đối
với đoạn ADN hay ARN nghiên cứu. Có nhiều phương
pháp khác nhau để phân tích nguồn ADN khuyếch đại
theo cách này. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng
điện di để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng
PCR. Có thể xác định độ nhạy và tính đặc hiệu cao
hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu đã
được đánh dấu. Phương pháp đưa lại thông tin nhiều
nhất là xác định được trình tự ADN và ARN của sản
phẩm PCR. Việc xác định được sai khác của chuỗi ADN
sẽ cho phép xác định và định typ chính xác nhất các
đối tượng vi sinh vật nghiên cứu. Kết quả xác định
trình tự ADN còn cho phép xác định mối liên hệ tiến
hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh vật.
- Đôi nét về phản ứng
chuỗi PCR:
Phản ứng chuỗi PCR nhằm
khuyếch đại ADN lần đầu tiên được Saki (1985) giới
thiệu và đây được coi là một trong những tiến bộ
khoa học quan trọng nhất về sinh học trong thập kỷ
80. Phản ứng PCR sử dụng enzym chịu nhiệt tạo ra
nhiều phiên bản theo hàm số mũ. Có thể ví dụ, chỉ
cần 1 sợi ADN sau vài giờ có thể nhân lên 1011
phiên bản ADN tương đương với 100 ng ADN. Sau khi
thực hiện phản ứng PCR thì cần tiến hành một số kỹ
thuật để xác định sản phẩm, đơn giản nhất là điện di
và xác định kích thước của sản phẩm PCR. Trong các
nghiên cứu chẩn đoán thì kết quả này rất có ý nghĩa,
nó chứng tỏ sự có mặt của ADN đích trong mẫu nghiên
cứu. Có thể nhận được tính đặc hiệu và độ nhạy cao
hơn khi sử dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR hoặc
lai với mẫu dò đặc hiệu. Tuy nhiên, thông tin đầy đủ
nhất vẫn là kết quả xác định trình tự ADN của sản
phẩm PCR.
Ngay từ khi được giới thiệu
thì PCR đã được xem là phương pháp đưa lại kết quả
khá nhạy trong việc xác định và phát hiện vi sinh
vật. Tính ưu việt của nó thể hiện ở chỗ có thể chỉ
cần một hạt virus hay một tế bào vi khuẩn nào đó
cũng đủ cho phản ứng xảy ra và khuyếch đại tới mức
có thể phát hiện được trong thời gian ngắn. Kỹ thuật
PCR còn được dùng để nhân ADN từ khuôn RNA sau khi
đã được chuyển thành cDNA sau phản ứng phiên mã
ngược (RT). Phương pháp này nhanh chóng được chú ý
và trở lên phổ biến cho các nghiên cứu phát hiện vi
khuẩn hay virus ở nồng độ thấp trong các mẫu môi
trường và bệnh phẩm. Ví dụ việc phát hiện mẫu máu
nhiễm HIV có nghĩa là phát hiện phần nhỏ ADN của
virus trong hệ gene người có kích thước gấp 100 000
lần. Mặt khác khi dùng kỹ thuật miễn dịch với kháng
thể thì phải cần tới 8 ngày mới có đáp ứng miễn dịch
trong máu, trong khi đó với kỹ thuật PCR thì toàn bộ
quy trình phát hiện chỉ mất vài giờ (đối với nguồn
ADN hay RNA). Lợi thế của kỹ thuật PCR được tận dụng
cho việc chuẩn bị ADN làm mẫu dò với số lượng lớn
cho các phép lai ADN đã trình bày ở trên. Các mẫu dò
có thể được đánh dấu bằng phóng xạ hay phi phóng xạ
khi tiến hành phản ứng khuyếch đại. Mẫu dò đánh dấu
với kỹ thuật PCR có ưu thế hơn các phương pháp đánh
dấu truyền thống bằng kỹ thuật tổng hợp các mạch đứt
gãy (nick translation) hay đánh dấu với mồi ngẫu
nhiên (rADN random primer labeling). Các ưu thế này
có thể kể đến, cụ thể như là cần lượng nhỏ sợi ADN
khuôn, có thể tiến hành đánh dấu với các mẫu dò có
kích thước ngắn, chuẩn bị mẫu dò không cần tinh sạch
ADN khuôn. Bảng 1.7. dưới đây liệt kê một số ví dụ
ứng dụng kỹ thuật PCR cho phát hiện nhiều đối tượng
vi sinh vật khác nhau. Rất nhiều các kết quả nghiên
cứu như vậy được trình bày trong các tạp chí chuyên
ngành như: ành như: ành như: ành như: Journal of Clinical Microbiology,
Applied Environmental Microbiology.
Bảng 1.7. Một số ví dụ về ứng
dụng kỹ thuật PCR trong xác định vi sinh vât.
Vi sinh vật |
Tài liệu |
Acanthamoeba sp
Bordetella pertussis
Borrelia burgdorferi
Brucella sp
Candida albicans
Carnobacterium
spp
Chlamydia trachomatis
Clostridium difficile
Coxiella burneti
Cryptosporidium
parvum
Cytomegalovirus
Dengue virus
Epstein-barr virus
Erwinia amylovora
Escherichia coli
Frankia spp
Gaeumannomyces
spp
Helicobacter pylori
Hepatitis C virus
Human
immunodeficiency virus (HIV)
Influenza virus
Leptospira
spp
Litsteria
monocytogenees
Luteovirus
Mycobacterium leprae
Mycobacterium
tuberculosis
Neisseria meningitis
Papillomavirus
Parvovirus
Plsmodium falciparum
Pneumocystis carini
Polio virus
Pseudomonas
solanacearum
Rickettsia
spp
Rotavirus
Salmonella
spp
Staphylococcus
spp
Toxoplasma gondii
Treponema pallidum
Trichomonas vaginalis
Trypanosoma cruzi
Vibrio vulnificus
Yersinia |
Vokin et al (1992)
Houard et al (1989)
Marconi ADN Garon (1992)
Herman an Derider (1992)
Miyakawa et al (1992)
Brook et al (1992)
Hayes et al (1992)
Gumerlock et al (1991)
Stein an Raoult (1992)
Laxer et al (1991)
Gozlan et al (1991)
Henchal et al (1991)
Samoszuk (1991)
Bereswill etal (1992)
Jackson (1992)
Simonet et al (1990)
Henson (1992)
Claton et al (1992)
Okamoto et al (1992)
Dawood et al (1992)
Claas et al (1992)
Merien et al (1992)
Niederhauser et al (1992)
Robertson et al (1991)
Hackel et al (1990)
Altamirano et al (1992)
Maiden et al(1992)
Charlotte et al (1993)
McOmish et al (1993)
Barker et al (1992)
Olsson et al (1993)
Yang et al (1991)
Seal et al (1992a)
Gage et al (1992)
Taniguchi et al (1992)
Rahn et al (1992)
Murakami et al (1991)
Vanevan et al (1991)
Grimprel et al (1991)
Riley et al (1992)
Breniere et al (1992)
Hill et al (1991)
Nakajima et al (1992) |
Sau đây là những nét chung nhất của
kỹ thuật PCR:
Nguyên tắc cơ bản của
PCR:
+ Khái quát chung:
PCR là phương pháp dùng enzym
khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ.
Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu
nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic
(dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng
nhân gene gồm 3 bước (xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1
là biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ
sợi khuôn xoắn kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào
hai sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo dài chuỗi theo
mồi, chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các
dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới
theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của phản ứng
được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo
trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả
tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.
Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có
kích thước 20-30 nucleotid được thiết kế theo trình
tự của đoạn gene cần khuyếch đại dựa theo dữ liệu có
sẵn. Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình
trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng phải bám đặc
hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như
vậy là do nếu chúng không bám vào vị trí đặc hiệu
thì không thể khuyếch đại được đoạn gene đích. Với
các gene có độ bảo thủ cao như rADN thì khi cặp mồi
được thiết kế thì chúng có thể nhân được gene từ
nhiều đối tượng. Ngược lại, trong nhiều trường hợp
dùng mồi không đặc hiệu thì có thể nhân được các sản
phẩm PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả
trên đều được dùng cho định typ vi sinh vật.
Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên
dùng mảnh Klenow của enzym ADN polymerase I từ
E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị biến tính tại 94oC
và như vậy cần phải bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ
phản ứng. Đến nay quá trình này đã được cải thiện do
dùng enzym Taq ADN polymerase
(Taq
= Thermus aquaticus
)
chịu nhiệt. Enzym này
được tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nước nóng. Tốc
độ xúc tác cho phản ứng của enzym này rất nhanh, có
thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại 755oC.
Hoạt tính enzym giảm một nửa khi xử lý tại 92.5oC
trong 230 phút hoặc 40 phút tại 95oC. Như
vậy khi dùng enzym này thì không cần bổ sung enzym
mới sau mỗi chu kỳ phản ứng.
+ Các thông số kỹ thuật:
Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt
đầu bằng việc tách ADN làm sợi khuôn. Nói chung,
theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho
phản ứng tạo ra sản phẩm nhưng trong thực tế cần
khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩn bị ADN theo
phương pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù
hợp cho phản ứng PCR. Tuy
nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của EDTA
(acide
éthylène-diamine-tétraacétique)
hoặc đệm phosphat vì kết quả sẽ làm giảm Mg++
(do EDTA hoặc tạo thành muối Mg3(PO4)2
khi nhiệt độ cao). Phản ứng PCR có thể nhân được
đoạn gene dài 10 Kb nhưng trong thực tế thường dùng
để nhân các đoạn có kích thước ngắn hơn (<2 Kb). Có
thể tham khảo các thông số thành phần phản ứng PCR
trong bảng dưới đây.
Bảng 1.8. Thành phần phản ứng
PCR.
Thành phần |
Số lượng |
ADN khuôn |
10-100 ng |
dNTP (mỗi loại) |
200 mM |
Mồi xuôi |
0.1 – 1.0 mM |
Mồi ngược |
0.1 – 1.0 mM |
Taq polymerase |
1 U |
KCL |
50 mM |
Tris HCL (pH 8.4) tại 25oC |
10 mM |
MgCl2 |
2.85 mM |
Gelatin |
100 mg/l |
Nonidet-40 |
0.05% |
Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản
phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ. Điều chú ý là các mồi
cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích
gần nhau, có trình tự không bổ sung nhau để tránh
bắt cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của các mồi cũng
phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm
để tránh tạo thành hiện tượng kẹp tóc. Nói chung,
ngày nay người ta có thể tối ưu hoá việc chọn mồi
nhờ sự trợ giúp của các chương trình máy tính.
Đôi khi cũng xuất hiện hiện tượng
nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu, điều này thường
hay xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi
acid amin. Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp
này thì việc thay đổi điều kiện phản ứng có thể hạn
chế được các sản phẩm không mong muốn. Các thành
phần như nhiệt độ, nồng độ Mg++ và enzym
có ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu. Sự có mặt của
nonidet-40 có tác dụng tăng hiệu suất của phản ứng.
Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP với
sản phẩm PCR có thể là cách nhanh chóng để tìm sự
khác biệt đối với các gene khác nhau. Với cách này
yêu cầu sản phẩm PCR phải sạch và đồng nhất. Theo
cách này trình tự có thể được thực hiện như sau: Sau
khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến
hành kết tủa với ethanol. Kết tủa được hoà với đệm
thích hợp và sau đó được xử lý với enzym cắt hạn chế
thích hợp. Kiểm tra kết quả thông thường trên gel
agarose, trong một số trường hợp có thể trên gel
polyacylamid để thu được độ phân giải cao hơn. Chú ý
rằng thông thường hoạt tính enzym giảm 5% sau mỗi
chu kỳ nhiệt. Như vậy có thể ước lượng 50% hiệu quả
khuyếch đại mất đi trong toàn bộ quá trình phản ứng.
+ Một số khó khăn với phản ứng
PCR:
PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn
trong nghiên cứu sinh học phân tử nhưng cũng nảy
sinh một số vấn đề cần chú ý đặc biệt khi phát hiện
một số bệnh virus hay vi khuẩn. Vấn đề ở đây là acid
nucleic của cả tế bào chết và tế bào sống đều cho
kết quả dương tính trong phản ứng PCR. Phản ứng nhạy
nên mọi sự nhiễm ADN đều có thể đưa đến sản phẩm
dương tính giả trong kết quả. Để hạn chế thực tế này
cần tiến hành với các mẫu đối chứng cần thiết để
biết được sự nhiễm tạp từ các thành phần phản ứng
hay từ dụng cụ thí nghiệm.
Một vấn đề nữa cũng cần đề cập là
sai số trong phản ứng nhân gene với enzym taq ADN
polymerase. Sai sót thêm nucleotid xảy ra với mỗi
một đơn vị sao chép khoảng 9000 nucleotid và đột
biến dịch khung xảy ra với số lượng tương ứng khoảng
40 000 nucleotid.
+ Một số kỹ thuật PCR khác:
Một số kỹ thuật phát triển trên
cơ sở của kỹ thuật PCR có ý nghĩa quan trọng cho
định danh và định typ vi sinh vật là nested PCR (PCR
lồng), revert transtriptase PCR (sao chép ngược) và
asymmetric PCR (PCR một chiều). PCR lồng là phản ứng
PCR bao bồm hai phản ứng đồng thời, phản ứng đầu ở
vòng ngoài gene và sản phẩm của nó lại làm khuôn cho
phản ứng sau cho đoạn nằm trong gene. Như vậy phản
ứng sau cần 1 hay 2 mồi để nhân phần gene nằm trong
sản phẩm PCR từ hai mồi phía ngoài tạo ra. Vai trò
kỹ thuật này làm tăng độ nhạy và đặc hiệu của phản
ứng PCR.
Phản ứng PCR
phiên mã ngược được dùng để nhân ADN từ ARN của
virus. Việc kết hợp phản ứng này với PCR lồng có tác
dụng phát hiện ARN tại thời điểm nhất định của mẫu.
Kỹ thuật PCR một chiều
được ứng dụng trong phương pháp giải trình tự ADN
trực tiếp từ sản phẩm PCR.phẩm PCR.
+ Sử dụng kỹ thuật PCR cho xác
định typ vi sinh vật:
Như đã trình bày ở trên, dùng cặp
mồi đặc hiệu có thể xác định được gene đặc trưng cho
loài hay thậm chí một chủng vi sinh vật nào đó. Các
chiến lược ứng dụng lợi thế của kỹ thuật PCR dùng
trong xác định typ vi sinh vật trong nghiên cứu dịch
tễ học được chia làm 4 nhóm sau:
- Phân tích RFLPs với sản phẩm
PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu.
Trong trường hợp này dùng kết hợp
kỹ thuật PCR và xử lý sản phẩm PCR với enzym cắt hạn
chế và quan sát kết quả sau khi điện di sản phẩm
trên gel agarose hoặc polyacrylamid Một dẫn chứng
cho kỹ thuật này là kết quả nhân gene synthase citrat
trong Ricketsiae sau đó sản phẩm PCR được xử
lý với enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các chủng
với nhau (Regnery và Ctv, 1991). Các ví dụ sau (bảng
1.8) đã cho thấy hiệu quả của phương pháp này.
Bảng 1.9. Một số ví dụ cho kỹ
thuật RFLPs (Restriction
Fragment Length Polymorphism)
phân tích các gene đặc hiệu được nhân lên
bằng kỹ thuật PCR.
Chủng vi sinh vật nghiên
cứu |
Tác giả nghiên cứu và tài
liệu dẫn |
Chlamydia spp. |
Kaltenboek et al (1992) |
Clostridium spp. |
Gurtler et al. (1991) |
Helicobacter pylori |
Foxall et al. (1992) |
Hepatilis C virus |
Okamoto et al.(1992) |
Mycobacterium tuberculosis |
Ross
&Dwyer(1993) |
Nitrobacter spp. |
Navarro et al.(1992) |
Rickettsia spp. |
Regnery et al. (1991) |
Streptococcus
spp. |
McClellADN et al. (1992) |
+ Dùng kỹ thuật PCR cho
ribotyping:
Kỹ thuật PCR
ribotyping là ứng dụng các cặp mồi đặc hiệu để nhân
các vùng gene của ARN (thuộc ribosom hay ARN vận
chuyển). Tuy nhiên, trong thực tế kỹ thuật này yêu
cầu kinh nghiệm, kỹ thuật và tốn thời gian để thực
hiện phép lai. Để khắc phục hạn chế này một cách
tiếp cận được trình bày ở đây là phân tích đa hình
(dấu vân tay) của vùng gene này hay vùng gene xen kẽ
của rARN hoặc tARN.
Hầu hết các chủng vi
khuẩn đều chứa 2-22 phiên bản rARN trong mỗi tế bào
(Gottlie và Rundner, 1985) trong khi đó vùng xen kẽ
giữa 16S và 23S chứa một số các đoạn ADN lặp lại
(Bacot và Reeves, 1991). Trong khi đoạn gene mã hoá
cho tARN khá bảo thủ thì vùng xen kẽ của tARN lại
thay đổi từ 2-35bp đối với Bacillus subtilis
(Vod, 1985) và từ 2-208bp trên đối tượng E.coli
(Jinks-Roberson và Nomura, 1987). Như vậy khi sử
dụng cặp mồi nhân toàn bộ vùng gene tARN có thể tạo
ra được sự khác biệt giữa các chủng vi sinh vật. Kết
quả ứng dụng kỹ thuật này trên một số đối tượng được
trình bày trong bảng 1.9.
Bảng 1.10.. Một số ví dụ sử
dụng kỹ thuật PCR cho ribotyping.
Vi sinh vật |
Tác giả và tài liệu dẫn |
Vi khuẩn lactic |
Klijin etal.(1991) |
Listeria |
Czajka et al.(1993) |
Mycoplasma |
Van
Kuppeveld et al.(1992) |
Pseudomonas cepacia |
Kostman et al.(1992) |
Pseudomonas solanacearum |
Seal
et al.(1992b) |
Staphylococcus
spp. |
Welsh &McClellADN(1992) |
Streptococcus
spp. |
McClellADN(1992) |
Khi số phiên bản rARN tăng có
nghĩa là làm tăng độ nhạy của phương pháp ứng dụng.
Engstrand và cộng tác viên (1920) đã công bố có thể
sử dụng mẫu dò là đoạn nucleotid bổ sung với đoạn
16S của rARN như là một trong số mồi cho phép nhân
phiên mã ngược ARN và phép phân tích được thực hiện
nhờ kỹ thuật PCR nhân sản phẩm cDNA được dùng cho
phát hiện Helicobacter spp. Độ nhạy của
phương pháp phát hiện này tăng 50 lần so với phương
pháp truyền thống.
+ Kỹ thuật rep-PCR:
Một phương pháp trực tiếp
cho kết quả finger printing không cần sử dụng enzym
cắt hạn chế là rep-PCR dựa trên nguyên tắc nhân các
đoạn gene lặp lại. Thuật ngữ rep-PCR là chỉ phương
pháp chung sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân các
chuỗi lặp lại phổ biến trong các vi sinh vật thuộc
cơ thể nhân sơ. Các chuỗi lặp lại có độ bảo thủ cao
trong các đối tượng thuộc Enterobacteriaceae
và một số đối tượng khác (Versalovic và Lupsky,
1991). Dùng các đoạn mẫu dò bảo thủ có thể lai với
cả hai đoạn ADN lặp lại: đoạn có kích thước 126bp
(Enterobacterial repetitive intergeneic
concensus-ERIC) và đoạn 38bp (repetitive extrageneic
palindromic-REP) từ bộ gene của Enterobacteriaceae
vi khuẩn gram âm và một số chủng có quan hệ xa khác.
Có thể trực tiếp thiết kế cặp mồi cho các đoạn gene
bảo thủ để thu được kết quả finger printing sau khi
nhân gene dùng bộ gene của các vi sinh vật có mang các
đoạn gene bảo thủ này. Sau khi điện di có thể phát
hiện được trên agarose các đoạn gene có kích thước
khác nhau từ các nguồn vi sinh vật khác nhau. Kỹ
thuật này được ứng dụng đã đem lại kết quả tốt khi
nghiên cứu mối quan hệ trên các đối tượng
Bacillus subtilis (Versalovic và cộng sự, 1992),
Citrobacter diversus (Woods và cộng
sự, 1991), Rhizobium meliloti (Brujin,
1992). Thực tế phương pháp tạo ra kết quả finger
printing đa dạng từ hầu hết các đại diện của
Enterobacteriaceae (Versalovic và cộng sự, 1991)
và được ứng dụng trên tất các vi khuẩn có mang các
đoạn gene bảo thủ lặp lại trên.
Phương pháp tương tự cũng cho
phép phát hiện sự khác nhau từ các nguồn ADN trên
các đối tượng nhân thực thuộc chi Naegleria
như mô tả của Belkim và Quint (1992). Phương pháp
này dùng cho phát hiện đa hình các đoạn gene chung
cho cả vi sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn.
+ Kỹ thuật RAPD
(Random amplified of polymorphic DNA):
Hạn chế của các phương pháp
nghiên cứu trước đây là phải dùng cặp mồi đặc hiệu.
Theo cách này phải có các thông tin liên quan đến
đoạn gene nhất định và đối tượng nghiên cứu. Khó khăn
này được loại bỏ trong trường hợp dùng các mồi ngẫu
nhiên hay tuỳ tiện, như vậy phương pháp phân tích
không cần đến thông tin về geneome của đối tượng
nghiên cứu…Cơ sở của phương pháp này đã được Welsh
và McClell ADN (1990) mô tả khi dùng mồi ngẫu nhiên
nhân gene và tạo ra phổ finger printing đặc trưng cho
từng hệ gene (geneome). Mồi ngẫu nhiên có thể chỉ gồm
5 bp để nhân gene có thể tạo ra kết quả finger
printing khá đa dạng. Có thể xem kết quả minh hoạ
trong bảng và hình sau.
Bảng 1.11. Ví dụ minh hoạ cho
kỹ thuật RAPD.
Đối tượng |
Tác giả và tài liệu dẫn |
Agaricus bisporus |
Khush&ctv(1992) |
Aspergillus fumigatus |
Aufauvre-Brown (1992) |
Bacillus
thuringiensis |
Brousseau&ctv (1993) |
Brucella
spp. |
Fekete&ctv(1992) |
Campylobacter
spp. |
Mazurier&ctv(1992) |
CADNida spp. |
Lehmann 7 ctv (1992) |
Casuarina
spp. |
Sellstedt& ctv(1992) |
Clostridium difficile |
McMillan& Muldrow(1992) |
Frankia spp |
Sellstedt& ctv(1992) |
Fusarium solani |
Crowhurst & ctv(1991) |
Helicobacter pylori |
Akopyanz & ctv(1992) |
Histoplasma
capsulatum |
Woods& ctv (1993) |
Lactococcus lactic |
Cancilla & ctv (1992) |
Leptosphaeria
maculans |
Goodwin&Annis(1991) |
Listeria
monocytogenees |
Czajka & ctv (1993) |
Porphyromonas
gingivalis |
Menard &ctv (1992) |
Rhizobium
spp. |
Harrison &ctv (1992) |
Staphylococcos
spp. |
Weish &McClellADN (1990) |
Streptococcus
spp. |
Weish &McClellADN (1990) |
Streptococcus uberis |
Jayarao &ctv (1992) |

Hình 1.9. Minh hoạ kết quả
phân tích sử dụng kỹ thuật RADP.
b. Giải trình tự ADN
Phương pháp chính xác và đưa lại
nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi
sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi ADN
của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Phương
pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng, kết
quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên
cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh
học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả
hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Các gene
bảo thủ được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị
trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình
tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự
biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá
thể gần với nhau.
+ Nguyên tắc:
Phương pháp giải trình tự ADN
theo nguyên tắc tạo ra các mảnh ADN được đánh dấu
tại đầu 5’ hoặc 3’. Các mảnh có các base đánh đấu
được tách ra trên gel polyacrylamid Các mảnh được
phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với
một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các
kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Việc tạo ra các
mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày
theo 2 phương pháp: phương pháp hóa học (Maxam &
Gilbert, 1997) và phương pháp enzym kết thúc phản
ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzym
được dùng phổ biến hơn cả.
+ Phương pháp enzym kết thúc phản
ứng chuỗi của Sanger:
Phương pháp kết thúc phản ứng
chuỗi được thực hiện dựa trên việc nhân ADN từ sợi
khuôn khi có đoạn ADN mồi với xúc tác của Klenow hay
T7-ADN polymerase và 4 loại deoxyribonucleotid
(dNTPs). Như vậy, có 4 phản ứng được tiến hành đồng
thời và trong mỗi phản ứng thì có một loại dNTP bị
thay đổi bởi một dẫn xuất để làm dừng phản ứng
(ddNTP). Kết quả là phản ứng chuỗi bị dừng đặc hiệu
cho mỗi một base xác định xảy ra một cách ngẫu nhiên
trong mỗi phản ứng. Trình tự của ADN được xác định
trên gel. Đầu tiên phương pháp này được xây dựng cho
xác định trình tự sợi ADN đơn tạo ra bằng cách tách
dòng ADN vào vectơ thực khuẩn thể M13 (Sanger và
cộng sự, 1978). Sau đó phương pháp xác định trình tự
sợi đôi ADN đã được Chen, William (1986) mô tả khi
tách dòng ADN vào plasmid. Ngày nay người ta lựa
chọn phương pháp Sanger để giải trình tự ADN cho
nghiên cứu phân loại và xác định typ vi sinh vật
thay cho phương pháp hóa học.
Một số lợi thế của phương pháp
này ở chỗ: Phương pháp này đơn giản và không tốn
nhiều thời gian như phương pháp hóa học. Khi nghiên
cứu phân loại và xác định typ thì các gene nghiên cứu
có độ bảo thủ nhất định vì vậy ta có thể dùng chung
mồi cho nhiều đối tượng khác nhau. Một trong hạn chế
của phương pháp này ở chỗ các đoạn ADN cần được tách
dòng trước khi tiến hành giải trình tự ADN. Tuy
nhiên cho đến nay người ta đã cải tiến phương pháp
này để có thể giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR.
+ Giới thiệu kỹ thuật
giải trình tự ADN theo Sanger:
Có hai phương pháp: Phương pháp
giải trình tự truyền thống đọc kết quả trên bản gel
(đánh dấu bằng phóng xạ là chủ yếu) và phương pháp
giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng
hóa chất huỳnh quang).
-
Phương pháp truyền
thống:
Các bước chính cho giải trình tự ADN
như sau:
Chuẩn bị ADN khuôn
Bắt cặp ADN khuôn và mồi
Tiến hành phản ứng giải
trình tự ADN
Tách sản phẩm trên gel
polyacrylamid biến tính với urea.
Đọc kết quả.
Tuy nhiên cần chú ý một số
điểm sau:
1.
Chuẩn bị ADN khuôn.
2.
Điều kiện bắt cặp mồi.
3.
Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN.
4.
Tách sản phẩm trên acrylamid gel.
5.
Đọc kết quả.
Một số điểm cần được chi tiết thêm
cho mỗi bước như sau:
1, Chuẩn bị ADN khuôn:
Sợi khuôn cần được hiểu là việc giải
trình tự được thực hiện với sợi đơn (vectơ M13) hay
sợi đôi ADN. Việc đọc trình tự theo sợi đơn thường
cho kết quả là kích thước đoạn gene đọc dài và độ
chính xác cao. Ngày nay người ta thường đọc sợi đôi
vì việc chuẩn bị mẫu dễ dàng hơn, ngoài ra khi sử
dụng hai phản ứng với hai mồi tương thích thì quá
trình đọc lại chính xác hơn. Đó là ưu thế của cách
đọc sợi đôi ADN. Do vậy, rất cần đọc kết quả từ cả
hai sợi ADN. Hiện nay phương pháp đọc trình tự ADN
trực tiếp từ sản phẩm PCR đang ngày càng trở lên phổ
biến.
2, Chuẩn bị sợi ADN mồi cho bước bắt
cặp vào sợi khuôn:
Người ta có thể dùng các đoạn ADN
mồi tiêu chuẩn đặc hiệu cho trình tự ADN của vectơ
gần sát với sợi khuôn hay primer đặc hiệu của sợi
khuôn mà nó sẽ bắt cặp vào. Tiện ích của việc dùng
mồi chuẩn ở chỗ mọi điều kiện đã được lựa chọn cho
sợi khuôn và mồi được dùng lặp đi lặp lại nhiều lần
cho các sợi khuôn khác nhau. Hạn chế của loại mồi
này ở chỗ chỉ đọc được một đoạn ngắn của gene (300 –
500 bps) trong trường hợp phải đọc các gene có kích
thước lớn cần phải tiến hành subclone để đọc tiếp.
Điều này có thể thực hiện bằng cách tạo ra các đoạn
ADN ngẫu nhiên từ toàn bộ gene sau đó lại gắn vào
vectơ để đọc cho hết trình tự của gene.
Phương pháp tiếp theo là sử dụng
mồi được thiết kế theo nguyên tắc bổ sung với trình
tự của gene. Theo cách này, lần lượt các đoạn được
đọc mà không cần thao tác subclone. Tuy nhiên theo
cách đoạn mồi được thiết kế để đọc gene như vậy thì
điều kiện cho từng phản ứng giải trình tự ADN với
các mồi khác nhau sẽ không được tối ưu. Tuy vậy,
hiện nay việc tổng hợp mồi đã trở nên dễ dàng và phổ
biến với giá thành thấp, hơn thế nữa với sự trợ giúp
của tin học thì bước thiết kế mồi đã được tối ưu
hoá. Vì vậy phương pháp này ngày càng trở lên thông
dụng hơn. Sau khi mồi đã được thiết kế thì việc tiếp
theo là chọn cách đánh dấu vào mồi hay vào đoạn ADN
sẽ được tổng hợp. Ưu thế của việc đánh dấu ngay tại
đầu 5’ của mồi ở chỗ các băng ADN thường có cùng một
cường độ tín hiệu. Thông thường với phương pháp đọc
trình tự thủ công thì P32 thường được
dùng. Ưu thế của nó là mang gốc photphat cao năng
bêta mạnh, do đó chỉ cần trong thời gian ngắn là thu
được tín hiệu. Hạn chế của phương pháp này là do
mang năng lượng cao nên khó phân biệt giữa các băng
khác nhau so với dùng S35. Hiện nay để
giải quyết vấn đề này người ta dùng P33
tuy giá thành cao nhưng cho kết quả tốt hơn.
3, Thực hiện phản
ứng giải trình tự ADN:
Enzym thông dụng thường dùng là
sequenase (là một dạng của T7 DNA polymerase), enzym
này có ưu thế hơn hẳn so với Klenow được dùng trước
đây. Phản ứng được thực hiện nhanh hơn và thu được
kết quả tối ưu nếu có mặt ion Mn++, ion
này giúp cho quá trình sao chép có độ chính xác cao.
Trước đây dNTPs đánh dấu với P32 được
dùng để đánh dấu sản phẩm. Tuy nhiên ngày nay nhiều
người đã chuyển sang dùng S35 thay thế
cho P32, kết quả là cho độ phân giải cao
hơn.
Mới đây phương pháp giải trình tự
dựa trên kỹ thuật PCR được gọi là chu kỳ giải trình
tự trực tiếp ADN đang thay thế phương pháp cũ dùng
enzym sequenase. Về nguyên tắc thì các phương pháp
này là giống nhau. Ưu thế của phương pháp này là:
lượng ADN đòi hỏi ít và không yêu cầu phải có mức độ
tinh sạch cao. Ngoài ra, có một ưu điểm nữa là phản
ứng xảy ra ở nhiệt độ cao, do đó đã khắc phục được
những hạn chế của các phương pháp khác khi giải
trình tự đối với các sợi khuôn có cấu trúc bậc 2
(Fan & cộng sự, tạp chí Biotechniques 21:
1132-1137).
4, Tách sản phẩm trên gel
urea-acrylamid:
Cho đến nay đã có nhiều tiến bộ
trong kỹ thuật điện di gel kể từ năm 1970 khi mà
người ta phát hiện ra phương pháp này. Tiến bộ quan
trọng nhất là gel gradient tạo ra độ dãn cách thích
hợp để đọc được thêm từ 50-100 base. Đầu tiên,
gradient được tạo ra giữa acrylamid và gradient muối
khi đổ gel. Có thể có cách khác nữa là người ta thay
đổi độ dày của gel bằng spacer. Phương pháp dễ nhất
là bổ sung nồng độ muối NaOAc vào bể đệm dưới khi
chạy gel, kết quả sẽ tạo ra một gradient cần thiết
mà không mấy khó khăn.
Có nhiều cách cải tiến khác nhau để
tạo ra gel có độ phân giải cao, ví dụ tạo ra
gradient đối với acrylamid mạch thẳng hay bổ sung
một số chất tạo ra gradient (Long Ranger). Mặt khác
việc đổ gel cũng được đơn giản hóa bước sử dụng băng
dán. Một số người dùng các gel siêu mỏng để đạt độ
phân giải cao. Nhiều thiết bị được phát minh nhằm
thu nhận các băng đã được tách riêng khi chúng ra
khỏi gel, và gần đây những thiết bị này đã được
thương mại hóa.
Nhuộm bạc là phương pháp tương đối
hiệu quả để xác định các trình tự ADN, cách này hạn
chế được nhiều bước dùng trong các kỹ thuật dựa vào
ảnh bức xạ mà không cần sử dụng chất phóng xạ.
5, Đọc trình tự gene:
Hiện nay kỹ thuật đọc phim tự động
đã thay thế công việc đọc trình tự ADN buồn tẻ trước
đây. Có hàng loạt các thiết bị từ loại có thể ghi
lại trình tự dựa vào việc chọn từng loại base đến
những thiết bị có thể thực hiện được toàn bộ quá
trình này một cách tự động.
Hy vọng rằng với những bàn luận ngắn
gọn này sẽ giúp bạn làm quen dần với nhiều loại kỹ
thuật khác nhau. Ngày nay các thiết bị giải trình tự
tự động càng trở lên thông dụng và việc sử dụng loại
thiết bị và hóa chất khác nhau rất đa dạng. Việc
chọn lựa thiết bị, hóa chất và phương pháp thích hợp
để giải trình tự ADN nhanh, chính xác và kinh tế là
điều cần được quan tâm đến.
* Một số phương pháp cụ thể
thường được dùng cho kỹ thuật giải trình tự ADN.
Phương pháp 1:
Tinh sạch Plasmid cho giải trình tự ADN.
Hiện nay có nhiều kỹ thuật tinh sạch
plasmid khác nhau, phương pháp được trình bày dưới
đây là phương pháp thu được plasmid có độ tinh sạch
cao, có thể dùng cho cả giải trình tự ADN thủ công
và tự động hóa. Quá trình này là cải tiến phương
pháp sử dụng dịch kiềm làm tan tế bào, sau đó sử
dụng sắc ký qua cột trao đổi ion. Cũng như các sản
phẩm được lưu hành trên thị trường của các công ty,
hạn chế lớn nhất của phương pháp này là giá thành
của nhựa trao đổi ion tương đối đắt. Thực tế có rất
nhiều công việc phải giải trình tự một cách thủ công
và các cán bộ nghiên cứu đã tìm ra nhiều phương pháp
tinh sạch khác nhau để thu nhận ADN đạt độ sạch cần
thiết, thậm chí có thể dùng cho giải trình tự ADN tự
động. Tuy vậy, nhiều người vẫn thích sử dụng cột
trao đổi ion, kết quả có thể đọc được tới 600 bps
hoặc nhiều hơn nữa.
Quá trình tinh sạch như sau:
+ Nuôi cấy vi khuẩn mang plasmid
trên môi trường chọn lọc với kháng sinh tương ứng
(khoảng 3 ml).
1, Phân 3 ml môi trường LB chứa
100 mg/ml apicilin trong ống nghiệm vô trùng (12X100
nm có nút).
2, Vô trùng đầu que cấy trên lửa
và làm nguội trên mặt đĩa thạch.
3, Lấy sinh khối từ một khuẩn lạc
và đưa vào ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy trên.
4, Nuôi cấy vi khuẩn 37oC
qua đêm có lắc vừa phải.
+ Chuẩn bị ADN dùng cột Qiagene:
Các cột Qiagene được chuẩn bị dễ
dàng và nhanh để tinh sạch ADN không cần dùng
gradient CsCl. ADN được chuẩn bị theo phương pháp
này đạt kết quả rất tốt cho việc biến nạp và giải
trình tự gene.
Có hai chú ý quan trọng khi dùng
cột Quiagene là: (1) Không sử dụng quá nhiều mẫu lên
cột, điều này rất quan trọng vì nếu dùng thể tích
quá nhiều kết quả là sẽ có nhiều protein ảnh hưởng
đến khả năng bám cột của ADN. Với cách này có thể
nhận được lượng ADN có chất lượng cao hơn từ thể
tích ít hơn. Nếu như lượng ADN thu được ít từ lần
thử đầu tiên thì cần thực hiện đúng theo chỉ dẫn để
lần thử thứ 2 với thể tích lớn hơn. Khi có một loạt
thể tích mẫu được Quiagene khuyến cáo lên cột để đạt
được hiệu suất tinh sạch cao nhất thì nên dùng lượng
dịch lên cột có thể tích nhỏ nhất. (2) Đảm bảo cột
phải được rửa hai lần trước khi giải phóng ADN ra
khỏi cột, điều này cũng rất có ý nghĩa vì việc rửa
như vậy sẽ loại trừ được protein và các thành phần
tạp nhiễm khác.
+ Các bước dùng cột trao đổi Qiagene
(tài liệu hướng dẫn sử dụng Quiagene):
1.
Ly tâm khoảng 1,3 ml dịch vi khuẩn mang
plasmid. Làm tan với 0.3 ml đệm P1 có RNase, chuyển
sang tube mới.
2.
Thêm vào 0.3 ml đệm P2 và trộn đều, giữ ở
nhiệt độ phòng 5 phút (không nên để lâu hơn).
3.
Thêm vào 0.3 ml đệm P3 trộn đều ngay nhưng
phải nhẹ nhàng, ly tâm ở 4oC trong 30
phút với tốc độ 15000 v/phút. Thu lấy phần trên tủa.
4.
Ly tâm lại như bước 3 một lần nữa để loại các
phần cặn nếu có.
5.
Cân bằng đệm cho cột Qiagene-tip 20 với 1ml
QBT và để cho đệm chảy hết tự do.
6.
Đưa phần dịch thu được ở bước 4 lên cột và để
tự chảy qua cột.
7.
Rửa cột 2 lần, mỗi lần 1 ml đệm QC.
8.
Thu ADN với 0.8 ml đệm QF.
9.
Kết tủa ADN với 0.7 thể tích isopropanol
(trước đó đưa về nhiệt độ phòng). Ly tâm 15000
v/phút tại 4oC.
10.
Rửa ADN thu được với ethanol 70%, để khô 5
phút và hoà tan lại trong thể tích đệm thích hợp
(25ml). Chú ý trong trường hợp mẫu dùng cho giải
trình tự ADN tự động huỳnh quang thì hoà tan mẫu
trong nước.
Nói chung sử dụng cột Qiagene thu
được trên 90% ADN và thường được dùng cho tinh sạch
Plasmid và cosmit (kích thước dưới 2 Kbs đến lớn hơn
50 Kbs). Số lượng plasmid thu nhận được từ tế bào
E.coli phụ thuộc vào hệ tế bào chủ, loại plasmid
từ thấp trung bình đến số lượng plamid cao và điều
kiện nuôi cấy (có thể tham khảo tài liệu liên quan
từ các chỉ dẫn của Qiagene để quyết định số lượng tế
bào dùng để xử lý cho mỗi loại kích thước cột).
Chú ý cách làm sạch
và tái sử dụng cột:
1, Thêm ethanol đầy vào cột,
ly tâm.
2, Bỏ ethanol và ly tâm lại
một lần nữa.
3, Lặp lại bước 1 và 2 với
nước cât.
4, Giữ cột ở trạng thái khô
cho đến lần sử dụng về sau.
(Cột có thể được dùng cho
nhiều lần tuy nhiên khi muốn tinh sạch ADN dùng cho
tách dòng thì nên dùng cột mới).
Các loại dịch đệm dùng cho cột
Qiagene:
Đệm P1 |
50
mM Tris -HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, Rnase A
pha
ngay trước khi dùng trong đệm P1 nồng độ 100
μg/ml |
Bảo quản
4oC |
Đệm P2 |
200
mM NaOH,1%SDS |
Nhiệt độ phòng |
Đệm P3 |
2,55M KAc, pH 4,8 |
Nhiệt độ phòng |
Đệm QBT |
750mM NaCl,50mM MOPS,15% ethanol, pH 7,0,
0,15% Triton X-100 |
Nhiệt độ phòng |
Đệm QC |
1M
NaCl, 50mM MOPS, 15% ethanol, pH 7,0 |
Nhiệt độ phòng |
Đệm QF |
1,25M NaCl, 50mM MOPS, 15% ethanol, pH 8,2 |
Nhiệt độ phòng |
Phương pháp 2.
Chuẩn bị gel cho giải trình tự ADN
Giới thiệu chung:
Phương pháp này giới thiệu cách
đổ gel, lên mẫu và chạy gel giải trình tự ADN. Có
nhiều cách đổ gel, có thể tham khảo các cách khác
nhau để chọn cách tiện ích nhất.
Điều quan trọng nhất là các bản
kính phải được rửa sạch tuyệt đối.
1, Mang găng tay và loại bỏ hết
bột găng tay đi. Rửa bản kính một lần với nước nóng.
Sau đó dùng bàn chải rửa với 0.5N NaOH. Lau bản kính
với dung dịch Alconox hay chất tẩy rửa có chức năng
tương đương. Sau đó rửa sạch lại bằng nước.
2, Rửa các bản kính với nước trao
đổi ion sau đó dựng lên giá cho khô, tránh bụi bám
vào kính. Lau với ethanol và dùng giấy Kimwipes hay
Scott Utinity để lau cho sạch không tạo vết. Kiểm
tra lại bụi bám vào kính để lau cho sạch, sau đó
kính được lau bằng lớp dịch Rain-X hay Sigmacott,
Gel Slick của hãng AT Biochem. Mục đích dùng chất
này là giúp cho việc đổ gel dễ dàng hơn và gel không
bị dính vào các bản kính.
3, Rửa lại bản đệm cách gel
(spacer) với nước đặt vào dọc theo hai cạnh đối xứng
của bản kính.
4, Ghép hai bản kính với nhau.
Đặt cẩn thận hai bản kính bằng nhau sao cho hai bản
spacer sát tận cuối bản gene (tạo mặt phẳng cùng với
hai bản kính). Nếu không đảm bảo mặt phẳng thì dễ bị
chảy gel trong quá trình đổ gel. Kẹp 2 cạnh của gel
tại 3 vị trí.
5, Chuẩn bị gel acrylamid 8% Long
Ranger (Hoefer Rig).
Trộn đều hỗn dịch:
16 ml Acrylamid Long
Ranger (LR) 50%.
5 ml 10X TBE
70 ml 10M Urea (46 gam)
Đưa đến thể tích 100 ml
với nước
Cho vào 800 μl 10%
Ammonium persulphat.
50 μl TEMED.
Quá trình
polyme hóa
được thực hiện trong 15 -20 phút.
Chạy gel LR trong dải nhiệt độ
50-55oC, nhiệt độ cao hơn 55oC
sẽ phá các liên kết acrylamid LR gel là dạng cải
biến cho gel acrylamid có một số ưu điểm sau: Thứ
nhất là LR gel với nồng độ cao hơn nhưng việc chạy
gel thì cũng như gel có nồng độ thấp thông thường,
ví dụ LR gel 5% tương đương 4% gel acrylamid với
bisacrylamid Thứ 2 là LR gel có khả năng phân giải
cao hơn và chạy với tốc độ nhanh hơn 30-40% gel
thông thường, gel LR khô nhanh hơn và không bị dính.
Một số chú ý khi thao tác::
a.
Trộn gel
nhẹ nhàng (tránh trộn mạnh).
b.
Hút dịch acrylamid
bằng pitpet hay có thể dùng cốc đong.
c.
Đặt bản
kính nghiêng 15o và đổ gel bằng cốc đong
hay pipet. Kiểm soát tốc độ đổ gel bằng góc nghiêng.
Tránh để dòng gel khi đổ ngắt quãng vì điều này sẽ
dẫn đến tạo bọt. Nếu phải dừng lại để hút dịch mới
vào syringer thì lúc đó phải hạ dần bản kính xuống
vị trí nằm ngang trước khi dừng đổ gel. Sau đó lấy
dịch gel mới vào syringer và tiếp tục đổ gel trước
khi gel lên khỏi vị trí nằm ngang. Cứ thao tác như
vậy đến khi đổ đầy bản gel.
Nếu xuất hiện bọt khi đổ gel thì
phải dừng lại ngay và nghiêng tấm kính để cho bọt
khí đi lên, có thể gõ nhẹ tay vào bản kính để cho
bọt khí đi lên hết. Phải loại hết bọt khí ra khỏi
gel, sau đó mới tiếp tục đổ gel.
6, Đặt gel nằm ngang và đưa cạnh
bằng của lược răng cá mập vào gel, tạo một góc hơi
nghiêng nhằm tránh tạo bọt khí. Chắc chắn rằng đã
đặt cạnh bằng của lược vào phía trên của gel và phần
răng cá mập sẽ nằm dọc theo đỉnh của bản kính dài
(lược sẽ nằm ngược với vị trí trong hình 1.10). Bổ
sung thêm gel và đẩy thêm lược vào đúng vị trí và cố
định lược lại bằng kẹp để tránh xê dịch.
7, Bao bọc gel với giấy nilon
SaranWrap để tránh gel tiếp xúc với không khí. Ngoài
ra có thể thấm giấy lọc với đệm TBE để đậy lên. Điều
này giữ cho gel luôn ẩm và tránh gel tiếp xúc với
oxy (oxy làm cản trở quá trình polyme hóa).
8, Quá trình polyme xảy ra từ 30
phút đến 1 giờ. Để xác định polyme hóa có thể hút
một ít gel vào pipét pastuer và để cho đến khi quá
trình polyme hóa xảy ra. Hoặc có thể lấy gel cho vào
ống falcon và đậy chặt nắp lại, trong nhiều trường
hợp thì gel chỉ nên polyme hóa trong 15-20 phút hoặc
nhanh hơn. Nếu quá trình polyme hóa không xảy ra thì
lại phải tiến hành rửa kính và đổ lại gel. Chú ý
nhiều khả năng quá trình polyme hóa không xảy ra do
Ammonium persulphat không còn tốt khi dùng lâu, nên
chuẩn bị dịch này để dùng trong tuần. Điều cần chú ý
nữa là gel phải được bọc kỹ với SaranWrap để qua
đêm.
9, Chuẩn bị gel trước khi chạy:
a. Lấy SaranWrap ra khỏi gel.
b. Đặt gel vào thiết bị điện di (bản
kính dài đặt áp vào thiết bị), chắc chắn là đã cắt
bỏ lớp băng dính ở đáy gel để việc điện di xảy ra.
c. Đổ 0,5X TBE vào bể đệm dưới
của thiết bị, lượng đệm cần phải đủ để cho bản gel
nằm trong đệm.
d. Đổ đệm vào bể trên của thiết
bị, đảm bảo gel nằm dưới lớp đệm. Kiểm tra xem đệm
có bị chảy ra hay không.
e. Chạy thử 20-30 phút tại hiệu
điện thế 2000V (phải cẩn thận vì rất nguy hiểm), sau
đó nhiệt độ của bản gel nên đạt tới 50oC.
10, Xử lý nhiệt với các mẫu ADN
điện di tại 85oC trong 5 hút và trộn đều,
để trên đá cho đến khi lên mẫu.
11, Tắt nguồn điện vào thiết bị
điện di (nhớ ngắt nguồn điện vào thiết bị trong bất
kỳ trường hợp nào khi thao tác với thiết bị).
12, Trong khi xử lý nhiệt với các
mẫu thì rửa bề mặt với đệm trong bể điện di, dùng
pipet hay syringer 60 ml. Mục đích của thao tác này
là loại lớp urea trên bề mặt gel.
13, Đánh dấu vị trí đỉnh của mặt
gel trên bản kính trước của gel.
14, Đặt lược răng cá mập lên mặt
gel, các răng được đặt trên mặt gel và ngập sâu vào
mặt gel khoảng 1 mm. Chắc chắn là vùng không gian
giữa các răng được giới hạn giữa các răng và gel.
Như vậy phần lược răng cá mập trở thành các cạnh bên
của giếng, bề mặt gel là đáy của giếng tra mẫu (hình
1.10).

Hình 1.10. Vị trí đặt lược sau
khi đổ gel.
Phải đảm bảo chắc chắn đã làm
sạch bề mặt gel trước khi đặt lược răng cá mập lên
trên gel. Nếu không thực hiện việc này sẽ không đọc
được phần kết quả phía trên của gel. Nếu quyên thực
hiện bước này có thể rửa sạch từng giếng tra mẫu
nhưng việc này sẽ khó khăn hơn. Nếu lên nhiều mẫu
thì trước đó cần phải phải làm sạch giếng vì urea sẽ
khuyếch tán và tích tụ tại bề mặt gel tại thời điểm
lên mẫu.
15, Việc xử lý nhiệt ở 85oC
đối với các mẫu điện di nhằm làm biến tính ADN, chỉ
lên khoảng 2-4 ml mẫu cho mỗi giếng (lên mẫu theo
thứ tự ACGT), có thể dùng bút để viết lên kính nhằm
tránh nhầm lẫn.
16, Quá trình điện di với hiệu
điện thế 2000V cho đến khi màu BPB (Bromophenolblue)
di chuyển đến tận cùng bảng gel (1-2 giờ). Nếu chạy
gel có gradient muối sẽ cho phép đọc được nhiều base
hơn trên một gel do việc làm ngắn lại khoảng cách
giữa các băng ADN ở phần cuối bản gel. Nên dừng điện
di từ 45 phút – 1 giờ. Tắt nguồn điện, bổ sung 1/2
thể tích 3M NaOAc vào bể đệm đáy, trộn đều. Lại tiếp
tục công việc chạy gel cho đến khi BPB di chuyển đến
cuối bản gel. Chú ý sự có mặt của muối nồng độ cao
sẽ dẫn đến nhiệt độ tăng, do đó cần phải kiểm soát
nhiệt độ của quá trình chạy gel nhằm tránh vỡ kính
và hỏng gel.
Chuẩn bị gel cho phát hiện bằng
ảnh phóng xạ.
17, Lấy bản gel ra khỏi thiết bị,
chú ý bể đệm đáy chứa chất phóng xạ, các nucleotid
dư sẽ đi ra khỏi bản gel.
18, Đổ bỏ bể đệm trên.
19, Đặt bản gel trên bàn thí
nghiệm sao cho tấm kính ngắn lên trên. Phủ lên một
lớp SaranWrap, dùng đá lạnh đặt lên trên khoảng 2
phút để cho gel co lại, dùng thanh nhựa tách các lớp
kính ra, giữ nguyên không cho tấm kính trên tiếp xúc
lại với gel vì như vậy gel sẽ dính và bị vỡ. Lúc này
gel sẽ chỉ dính vào tấm kính dưới không có silicon
được phủ khi đổ gel.
20, Đặt tấm giấy Whatman lên trên
gel và vuốt đều nhẹ nhàng, lúc đó gel sẽ dính vào
giấy và có thể lấy ra dễ dàng (Chú ý trong trường
hợp sử dụng chất phóng xạ là S35 thì nên
cố định mẫu theo cách dưới đây).
21, Sau khi lấy gel ra hỏi tấm
kính đáy thì bọc gel với SaranWrap, chú ý tránh
không khí đi vào giữa lớp SaranWrap và gel, điều này
sẽ cản trở ảnh phóng xạ trên phim.
22, Có thể đưa vào thiết bị sấy
gel.
23, Sấy gel trong khoảng 45 phút
tại 80oC.
24, Đặt phim X-ray theo
đúng chỉ dẫn vào gel trong hộp cassette (có phim chỉ
có một mặt thì mọi thao tác phải đúng để có ảnh
phóng xạ). Thời gian nhận được bức xạ là 12-14 giờ
đối với P32 và 24-48 giờ đối với S35.
25, Đọc kết quả.
Cố định gel: Mục đích của
bước này là loại bớt urea khỏi gel vì sự có mặt của
urea sẽ hạn chế sự phân cách giữa các ADN, các bước
được thực hiện như sau:
+ Đặt bản kính có
gel vào khay chìm trong hỗn dịch 15% ethanol và 10%
acetic acid.
+ Cố định trong
10-15 phút đủ để urea khuyếch tán khỏi gel.
+ Dùng giấy lọc để
thấm hết dịch cố định khỏi gel.
+ Tiếp tục làm theo
các bước như quy trình hiện ảnh phóng xạ.
Hóa chất và cách
chuẩn bị:
Phương pháp: Giải
trình tự ADN sợi kép sử dụng KIT biến tính nhanh với
sequenase.
Phương pháp này
thích ứng với việc giải trình tự các plasmid sợi
đôi. Bắt đầu bằng việc gây biến tính trong kiềm
(NaOH) hoặc glycerol, sau đó kết tủa ADN và bắt cặp
với ADN mồi dùng để giải trình tự. Phương pháp giải
trình tự ADN với sợi đôi cần lượng ADN mồi cao gấp
10-20 lần so với sợi đơn. Việc giải trình tự gồm hai
phản ứng: phản ứng đánh dấu và phản ứng dừng tại
điểm cuối. Trong phản ứng đánh dấu các sợi ADN bổ
sung được gắn kết với chất đánh dấu phóng xạ trong
việc kéo dài chuỗi. Sau đó phản ứng kéo dài chuỗi
ADN bị dừng một cách ngẫu nhiên do nồng độ thấp của
nucleotid trong dịch phản ứng (0.08 mM). Bước tiếp
theo là kết thúc chỗi với dideoxynucleotid khi có
nồng độ cao của deoxyribonucleotid (33,3 mM). Các
trình tự tiếp theo của sợi khuôn sẽ được xác định
với nồng độ cao của deoxynucleotid trong khi phản
ứng đánh dấu xảy ra trước việc bổ sung
dideoxynucleotid vào hỗn hợp phản ứng. Quy trình sau
đây đã được rút gọn, có nhiều phần tiện ích chi tiết
hơn và thay đổi trong các tài liệu hướng dẫn.
Điều quan trọng để có kết
quả tốt trong việc giải trình tự ADN là chất lượng
cao của ADN plasmid. Trong các khâu chuẩn bị việc
xuất hiện các phân tử đứt gãy sẽ dẫn đến kết quả
không rõ, khó xác định các băng. Các plasmid sợi đơn
phải được làm biến tính cho mở xoắn trước khi giải
trình tự. Biến tính các plasmid xoắn do liên kết hóa
trị không phải lúc nào cũng đạt được bằng xử lý
nhiệt tại nhiệt độ bắt cặp mồi hay trong đệm phản
ứng, bởi lẽ nhiệt độ mở xoắn thường là 105ng là 105oC.
Có hai phương pháp khá nhanh và tiện lợi: Một phương
pháp xuất phát từ thực tế là glycerol hoặc ethylen
glycerol có tác dụng làm giảm nhiệt độ mở xoắn, còn
phương pháp thứ 2 là mở xoắn bằng môi trường kiềm.
Cả hai phương pháp đều thực hiện đơn giản cho hầu
hết các loại ADN khuôn.
Đối với hai phương pháp biến tính
ADN, nên dùng lượng ADN khuôn ở nồng độ 0.5 pmol
(05- 0.3 mg) và lượng primer 2-5 pmpol. Nếu sử dụng
thể tích ADN nhỏ hơn thì phải pha đến nồng độ thích
hợp bằng nước. Kết quả tốt nhất thu được là theo tỷ
lệ phân tử mồi : sợi khuôn là 4 : 1. Tỷ lệ này nên
được duy trì khi tiến hành với lượng ADN khuôn khác
nhau. Trong mọi trường hợp khi mà số lượng thành
phần nào quá ít thì đều dẫn đến băng không rõ ở cuối
bản gel. Lượng ADN khuôn cần theo phương pháp này ít
hơn so với sử dụng sequenase KIT 2.0 do không bị mất
ADN trong bước kết tủa với ethanol. Tác nhân gây
biến tính ADN khuôn trong KIT này là đệm 40:50
glycerol và ethylen glycerol. Việc bổ sung đệm này
vào dung dịch ADN theo tỷ lệ chỉ dẫn; 40% glycerol
sẽ làm giảm nhiệt độ biến tính ADN xuống khoảng 20oC.
Chý ý khi dùng đệm glycerol sẽ gây nên việc di
chuyển không đều trên gel điện di tại vùng có khoảng
cách 300-400 kể từ đoạn ADN mồi. Nên sử dụng đệm
chạy gel hạn chế tác dụng của glycerol (thay taurin
cho đệm chạy gel TBE) sẽ khắc phục được điều này.
ADN plasmid sẽ biến tính tại bất
kỳ nhiệt độ nào ở pH kiềm (pH 13). Điều quan trọng
đối với phương pháp này là việc trung hòa bước biến
tính kiềm bằng HCL phải được thực hiện một cách
chính xác. Như vậy nên dùng một loại pipet cho việc
bổ sung kiềm và trung hòa bằng acid HCL sau đó. Nói
chung dung dịch NaOH và HCL được chuẩn bị có nồng độ
1M, trong trường hợp dùng hóa chất riêng phải đảm
bảo nồng độ chỉ dao động trong khoảng 0,95- 1.05M.
Bước gây biến tính kiềm và kết tủa với ethanol cũng
có thể được thực hiện với các hóa chất trong KIT
nhưng đôi khi cũng không đạt được kết quả mong muốn
và cần phải cải tiến.
Trong trường hợp giải trình tự
với ADN sợi đơn, không phải thực hiện bước biến tính
ADN, hỗn dịch được chuẩn bị đơn giản gồm: ADN
plasmid, 05 pmol primer, 2 ml đệm phản ứng và bổ
sung nước cho đủ 15 ml.
Phản ứng tốt sẽ đọc được trình tự
dài khoảng 400 bps.
Cách tiến hành cụ thể:
1.
Biến tính ADN (theo hai cách trình bày ở
trên).
A.
Biến tính với glycerol:
ADN: 0.5 – 0.3 mg (thể
tích tối đa 7 ml).
Đệm biến tính plasmid: 5
ml.
Primer:
1 ml.
Nước cất dẫn đến: 13
ml.
Trộn đều, ủ trong 5 phút ở 90 – 100
oC, làm lạnh nhanh trên đá.
Bổ sung thêm đệm phản ứng: 2 ml để
đạt được tổng thể tích là 15 ml.
B. Biến tính
với kiềm (không cần kết tủa với ethanol).
Thành phần phản ứng gồm:
ADN: 0.5 - 3mg (thể tích tối đa
là 8ml)
NaOH 1M: 2
ml.
Primer:
1 ml.
Nước cất dẫn đến: 11 ml.
Trộn đều,
giữ trong 10 phút tại 37oC, làm lạnh
nhanh trên đá.
Điều quan trọng trong phương pháp
này là bước trung hòa phải được thực hiện chính xác
với HCL.
Sau đó bổ sung HCL 1M : 2 ml.
Đệm phản ứng
plasmid: 2 ml.
Tổng thể tích là:
15 ml.
2.
Bắt cặp
mồi vào sợi khuôn:
Giữ hỗn dịch ADN và mồi ở 37oC
trong 10 phút, sau đó giữ trên đá lạnh (mẫu chỉ nên
dùng trong vòng 4 giờ).
3.
Chuẩn
bị tube chứa hỗn dịch kết thúc chuỗi:
Trong khi thực hiện bước bắt cặp
sợi khuôn và sợi mồi, tiến thành hút 2,5 ml hỗn dịch
kết thúc chuỗi cho từng loại (ddA, ddC, ddG, ddT)
cho vào từng tube riêng biệt. Đậy nắp, để trên đá để
dùng cho các bước 5 và 7.
4. Pha loãng dịch đánh
dấu:
Pha loãng dịch đánh dấu 5 lần với
nước và giữ trên đá. Không nên pha loãng dịch đánh
dấu khi muốn đọc đoạn ở xa mồi.
Dịch đánh dấu:
2 ml
Nước: 8 ml
Tổng
số: 10 ml.
5. Làm ấm
các mẫu đá chuẩn bị trong bước 3:
Bốn mẫu được chuẩn bị trong bước 3
lần lượt là ACGT được ủ ở 37oC trong 1
phút.
6. Phản ứng đánh dấu (kể từ bước này
thì mọi đầu côn và pipét sẽ thực hiện với hóa chất
phóng xạ, do đó cần phải có các biện pháp bảo vệ và
đeo găng tay).
Bổ sung lần lượt các thành phần sau
vào 15 ml hỗn dịch bắt cặp đã được chuẩn bị trong
bước 1.
DTT 0.1M
: 1 ml
Dịch đánh dấu (bước
4): 2 ml
Hóa chất phóng xạ: S35
(P33, P32): 0.5 ml
Enzym T7
sequenase cho
plasmid: 2 ml
Tổng thể tích
: 20.5 ml
(Thể tích này sẽ được chia ra 4
phần trong bước 7)
Trộn đều (tránh bọt), ủ hỗn dịch tại
nhiệt độ phòng 2 -5 phút (đối với plasmid làm biến
tính trong glycerol thì ủ 5-10 phút tại nhiệt độ
phòng hoặc 5 phút tại 37oC). Thường bổ
sung hỗn dịch T7 sequenase cho plasmid cuối cùng,
sau khi các thành phần khác đã được bổ sung. Không
bao giờ bổ sung hỗn dịch T7 sequenase cho plasmid
vào hỗn dịch đánh dấu, DTT hay hỗn dịch khác không
phải là đệm.
Chú ý: Nếu trong trường hợp chất
phóng xạ S35 để quá lâu thì có thể tăng
lượng lên 2 ml cho mỗi phản ứng, sau đó giảm lượng
nước tương ứng.
7. Phản ứng kết thúc chuỗi:
a. Lấy 4,5 ml hỗn dịch thu được từ
bước 6 cho vào thành trên của 4 tube kết thúc chuỗi
đã được làm ấm ở bước 5 (A, C, G, T). Đậy nắp lại và
li tâm nhanh để trộn đều, tiếp tục ủ trong 5 phút
tại 37oC (có thể kéo dài tới 30 phút).
Nếu thấy cần thiết thì có thể li tâm nhanh để thu
lấy hỗn dịch trước khi tiến hành phản ứng đánh dấu.
b. Tại thời điểm cuối của 5 phút, bổ
sung 4 ml hỗn dịch dừng phản ứng vào thành trên của
các tube và đóng nắp nhanh. Như vậy có thể dừng phản
ứng tại thời gian thích hợp bằng cách li tâm để dịch
dừng phản ứng đi xuống hỗn dịch phản ứng.
c. Ngay lập tức li tâm để dịch dừng
phản ứng đi xuống hỗn dịch phản ứng, sau bước này
phản ứng đánh dấu đã hoàn tất và mẫu có thể được giữ
ở 4 oC để sử dụng trong ngày hôm sau.
d. Xử lý ở nhiệt độ 75oC
cho các mẫu khoảng 2-3 phút ngay trước khi tra mẫu
lên gel, với các mẫu chứa glycerol thì việc lên mẫu
dễ dàng với đầu côn vàng.
e. Lên khoảng 2-3 ml mẫu cho mỗi
giếng trên gel giải trình tự. Nên đưa một lượng đồng
mẫu trên các giếng. Cách tốt nhất để lên mẫu không
bị bọt là hút 3 ml mẫu nhưng khi tra chỉ dùng 2 ml
là đủ.
Hóa chất:
Hỗn dịch kết thúc chuỗi:
Tube |
A |
C |
G |
T |
dATP |
80μM |
80μM |
80μM |
80μM |
dCTP |
80μM |
80μM |
80μM |
80μM |
7-deaseGTP |
80μM |
80μM |
80μM |
80μM |
dTTP |
80μM |
80μM |
80μM |
80μM |
ddATP |
8μM |
|
|
|
ddCTP |
|
8μM |
|
|
ddGTP |
|
|
8μM |
|
ddTTP |
|
|
|
8μM |
NaCl |
50 mM |
50 mM |
50 mM |
50 mM |
|
|
|
|
|
Dịch dừng phản
ứng:
95% Formamide
20mM EDTA (Na2), pH 8.0
0.05% Bromopheno Blue (BPB).
0.5% Xylen
CyanolFF (XC).
Chú ý, nếu bạn gặp trục
trặc với việc giải trình tự ADN thì các plasmid nên
được tái tinh sạch với Genee-Clean hoặc sắc ký trao
đổi ion.
Hình 1.11. Tra mẫu trên thiết
bị chạy gel.
Các phần dưới đây đề cập đến một
số vấn đề nảy sinh và cách giải quyết khi tiến hành
giải trình tự ADN.
- Muốn đọc được trình tự ADN dài
hơn:
Yêu cầu đầu tiên là phải đọc được
đoạn gene đến mức có thể trên gel. Thông thường thì
kích thước đọc cho mỗi phản ứng trên gel là 250-300
nucleotid. Với thời gian chạy gel lâu khoảng 8 giờ
thì có thể đọc được kích thước gene dài hơn 400
nucleotid. Nếu sử dụng gel gradient sẽ không phù hợp
cho mục đích này vì khoảng cách giữa các băng ADN sẽ
hẹp tới mức không thể đọc được. Nồng độ gel
acrylamid dao động 4-6% là thích hợp cho kết quả
tốt. Có một giải pháp nữa là có thể sử dụng gel với
gradient muối nhưng vẫn giữ nguyên thời gian chạy
gel (xem phương pháp 2, bước 16).
- Sự dồn các băng:
Nguyên nhân chung để không thể
hoàn tất việc giải trình tự ADN là các băng không rõ
do cấu trúc bậc hai trong sản phẩm của phản ứng kéo
dài chuỗi, điều này thường được mô tả là sự dồn ép
các băng do các băng bị thu hẹp một cách bất thường
trên ảnh fim của kết quả giải trình tự ADN. Các
khoảng cách hoàn toàn như nhau khi mà khoảng 3 liên
kết G-C bổ sung kèm với 2-5 base có thể dẫn đến kết
quả không thể đọc được đoạn gene chiếm một khoảng nhỏ
trên bản gel. Khoảng trống bất thường là do ảnh
hưởng của chuỗi với khoảng cách ngắn của cấu trúc
bậc 2 sẽ có cùng tốc độ di chuyển như là sợi thẳng
có chiều dài ngắn, tại ví trí bản fim ngoài vùng dồn
băng thì khoảng cách các băng sẽ rộng khác thường do
sự kém bền của cấu trúc bậc 2 làm cho chiều dài của
chuỗi tăng lên và sự di động của chuỗi trở nên như
bình thường.
Việc giải trình tự qua vùng gene
dồn nén có thể được khắc phục bằng cách thực hiện
việc đọc trình tự trên cả hai sợi. Sự bất thường về
việc di chuyển nảy sinh ở các chuỗi có chiều dài
không đủ cho việc bắt cặp. Điều này có nghĩa vùng
gene có các băng không rõ ràng sẽ được khắc phục bằng
cách sử dụng dITP thay cho dGTP trong phản ứng giải
trình tự ADN. Lý do là base I chỉ có 2 liên kết với
C thay vì 3 liên kết trong trường hợp với G, kết quả
là ADN sẽ dễ duỗi hơn. Kỹ thuật này thường được
dùng, do đó dITP có trong KIT sequenase.
Một cách khác có thể làm kém bền
vùng base dồn nén do còn cặp đôi đó là thực hiện
chạy gel trong điều kiện biến tính (ví dụ sử dụng
formamide trong nước dùng đổ gel). Trong trường hợp
này khi thay thế 25% formamide cho nước sẽ đạt được
kết quả tốt nhất. Gel có formamide thường được dùng
khi vùng dồn nén khá gần mồi, nên xử lý formamide
qua gel trao đổi ion ngay trước khi chuẩn bị gel.
Trong các trường hợp mà các cấu
trúc cặp đôi phức tạp hơn khi mà vùng dồn nén lại
nằm ngay tại vị trí tương đồng trên sợi đối diện.
Khi đó cách giải quyết sẽ trở nên khó khăn vì với
các kỹ thuật hiện có thường đưa lại các kết quả khác
nhau.
- Cường độ các băng thiếu sự đồng
nhất:
Một vấn đề khác trong phản ứng
giải trình tự ADN là cường độ các băng không đồng
nhất. Điều này thường xuất hiện trong phương pháp
giải trình tự với thiết bị tự động dựa vào phương
pháp phát hiện bức xạ huỳnh quang. Sự thiếu đồng
nhất là do sự có mặt của sequenase cần Mg++
gắn dideoxy kết thúc chuỗi khác nhau tại các vị trí
khác nhau (vấn đề này được bàn luận kỹ trong tài
liệu USB sequenase).
b.
Kỹ thuật giải trình tự ADN trên thiết bị giải
trình tự ADN tự động:


Hình 1.12. Thiết bị giải trình
tự ADN tự độngg
(3100-Avant Genetic Analyzer)
Trong phần này chúng
tôi đề cập phản ứng giải trình tự ADN trên 2 loại
thiết bị chủ yếu hiện đang được dùng phổ biến là:
Beckman Coulter và ABI 3100-Avant
Chuẩn bị mẫu giải
trình tự ADN:
1.
Thành
phần phản ứng (cho 1 phản ứng 20
ml):
- Terminator Ready Reaction Mix*:
8 μl
- Template:
80-100 ng
( với plasmid là:
300ng)
- Primer :
3.2 pmol
- Nước cất vô trình: đủ 20
μl
Chuẩn bị Teminator Ready Reaction
Mix cho 4 phản ứng:
15 μl
Bigdye Sequencing Buffer
3.1 (5X) + 15 μl
nước = 30 µl (2.5X)
20 μl
đệm 2.5X + 20 μl
Ready Reaction Premix= 40 μl
Terminator Ready Reaction Mix (dùng 8 μl)
cho một phản ứng.
2. Tiến hành phản ứng:
Phản ứng được thực hiện trong 200
ml tube hay trong microplate.
Cycling được thực hiện trong máy
PCR theo chương trình sau:
Denature 96oC:
1 phút
96 oC:
10 giây
50oC:
5 giây
60oC:
4 phút
Cycling: 25 cycles.
3. Kết tủa sản phẩm
PCR:
- Cho vào 5µl EDTA 125
mM + 60µl E-OH 100%E-OH 100%
- Trộn đều, để 15 phút ở
nhiệt độ phòng. Ly tâm 15 000 v/phút
- Rửa lại bằng 60µl E-OH
70% và lại ly tâm (4oC)
- Làm khô mẫu ở nhiệt độ
phòng (Speed Vac).
- Khi mẫu khô, thêm 10µl Hi-Di
formamide, trộn đều sau đó ủ ở 96oC trong
2 phút.
- Để trên đá trước khi
cho vào seq.
4. Đưa mẫu vào máy đọc
trình tự.
Phòng thí nghiệm "ảo" :
http://web.mit.edu/7.02/virtual_lab/PBC/PBC5virtuallab.html
Formazan gồm
MTT (3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,
5-dihphenyl-2H-tetrazolium bromide)
và nước hòa tan XTT
(23-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide).