1. Phiếu thông tin về chủng vi
sinh vật bảo quản:
Đại học Quốc gia Hà Nội
Trung tâm Công nghệ Sinh học
Bảo tàng Giống chuẩn vi sinh vật
(VTCC) |
Thông tin chung về
chủng vi sinh vật bảo quản |
1.
Nấm sợi
Nấm men
Xạ
khuẩn
Vi khuẩn
2. Tên khoa học:
Giống (Genus)
Loài (Species) Dưới
loài (Subspecies)
Tên khác nếu có (synnonym):
3. Nguồn phân lập:
Nơi phân lập:
4. Thời gian bắt đầu bảo quản tại
VTCC:
5. Người phân lập:
6. Người cung cấp:
Nơi cung cấp:
7. Ký hiệu chủng VTCC:
8. Ký hiệu là lý lịch chủng từ
các bảo tàng khác:
VTCC < < <
< <
9.
Chủng chuẩn (Type)
Chủng tự nhiên
(wild)
Đột biến (cụ thể…)
10. Hình thức sinh sản:
11.
Gây bệnh cho: Người
Động
vật
Thực vật
Không
12. Dấu chuẩn di truyền (nếu có):
13. Hình thái tế bào, khuẩn lạc:
14. Khả năng ứng dụng:
15. Tài liệu liên quan:
16. Các phương pháp bảo quản:
Đông khô
Lạnh sâu
Nitơ
lỏng
Cấy truyền
17. Môi trường nuôi cấy thích
hợp:
18. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp:
19. Ghi chú:
2. Chức năng của bộ sưu tập vi
sinh vật:
Bảo quản vi sinh vật có tầm quan
trọng đặc biệt, làm nền tảng cho các nghiên cứu cơ
bản và ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh
học, y học, nông nghiệp và môi trường.
Nhiệm vụ quan trọng nhất của Bộ
sưu tập chủng vi sinh vật là thu thập, làm giàu các
chủng vi sinh vật hữu ích và bảo quản chúng theo
phương pháp thích hợp. Việc thu thập các chủng vi
sinh vật có thể bằng nhiều cách như phân lập, tuyển
chọn từ môi trường, trao đổi trong nước và quốc tế.
Các chủng vi sinh vật phải được định hướng theo từng
mục tiêu cụ thể của từng Bộ sưu tập, ví dụ các chủng
vi sinh vật chuẩn, các chủng có hoạt tính sinh học
và các chủng làm cơ sở cho tra cứu khi nghiên cứu
tính đa dạng của vi sinh vật.
Bảo quản các chủng vi
sinh vật là công việc không dễ dàng, xuất phát từ
mục đích của bảo quản không những là duy trì khả
năng sống của vi sinh vật, thuần chủng, tránh tạp
nhiễm mà còn đảm bảo tính ổn định di truyền và các
đặc tính sinh học trong suốt quá trình bảo quản.
Thực tế không có một phương pháp bảo quản nào là vạn
năng dùng chung cho các nhóm vi sinh vật mà mỗi nhóm
vi sinh vật chỉ thích hợp với một vài phương pháp
bảo quản nhất định.
Các chủng vi sinh vật
bảo quản sẽ được cung cấp cho người sử dụng do đó
nhiệm vụ quan trọng của bộ sưu tập vi sinh vật là
thu thập và cung cấp các thông tin quan trọng của
chủng vi sinh vật bảo quản cho người sử dụng như:
môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, nhu cầu dinh dưỡng,
tính an toàn sinh học, tên phân loại v.v..Như vậy
yêu cầu đối với cán bộ phụ trách Bộ sưu tập vi sinh
vật phải có kiến thức vững về vi sinh vật, di truyền
học, sinh hoá học, sinh lý vi sinh vật và bệnh học
vi sinh vật để kiểm soát được các đặc tính quan
trọng của các vi sinh vật bảo quản.
3. Một số điểm lưu ý đối với
một Bộ sưu tập vi sinh vật:
3.1. Duy trì khả năng sống của vi
sinh vật bảo quản:
Trong khi thực hiện các
phương pháp bảo quản và trong quá trình bảo quản các
tế bào vi sinh vật sẽ bị chết do đó phải áp dụng
phương pháp bảo quản thích hợp nhằm hạn chế thấp
nhất khả năng chết của tế bào.
3.2. Quan tâm đến số lượng tế bào
khi tiến hành bảo quản:
Trong quá trình bảo quản
thì số lượng tế bào vi sinh vật giảm dần theo thời
gian do vậy cần tính toán số lượng vi sinh vật tại
thời điểm bảo quản thích hợp để duy trì số lượng vi
sinh vật sống trong thời gian bảo quản dài.
3.3. Duy trì đặc tính di truyền
ổn định của chủng vi sinh vật bảo quản:
Nói chung với các chủng
vi sinh vật bảo quản, đặc biệt với các chủng vi sinh
vật chuẩn, các chủng vi sinh vật có ứng dụng trong
công nghiệp thì yêu cầu duy trì đặc tính sinh học,
tính trạng di truyền là rất quan trọng. Các phương
pháp bảo quản không thích hợp có thể dẫn đến đột
biến hoặc mất plasmid. Vì vậy cần phải chọn các
phương pháp bảo quản thích hợp cho các chủng này.
3.4. Tính thuần chủng của vi sinh
vật bảo quản:
Chủng vi sinh vật từ khi
bảo quản đến khi sử dụng phải đảm bảo thuần chủng
đúng theo tên và các đặc điểm sinh học đặc trưng.
Đây cũng là yêu cầu tiên quyết đối với công việc của
một Bảo tàng vi sinh vật, do vậy mà các thao tác và
phương pháp tiến hành phải được thực hiện sao cho
hạn chế tới mức tối thiểu đối với các chủng bảo quản
nhằm tránh tạp nhiễm.
3.5. Kinh phí cần cho Bộ sưu tập
vi sinh vật:
Kinh phí bao gồm kinh
phí về lương cho cán bộ, thiết bị, vật tư hoá chất,
nhà xưởng và điện nước tiêu hao. Các kinh phí này
tuỳ thuộc vào quy mô của Bộ sưu tập giống vi sinh
vật và phương pháp bảo quản, phạm vi dịch vụ thực
hiện đối với khách hàng.
Tên Bảo tàng vi sinh
vật (viết tắt)
|
Nước |
Số lượng chủng vi
sinh vật |
ATCC |
Mỹ |
73507 |
DSMZ |
Đức |
14460 |
NBRC |
Nhật |
18300 |
Bảng 1. Quy mô của một số bộ
sưu tập giống vi sinh vật.
STT |
Tên Bảo tàng vi sinh
vật, Nước |
Giá thành (USD) |
1 |
ATCC, Mỹ |
80 |
2 |
CBS, Hà Lan |
60 |
3 |
VKM, Nga |
45 |
4 |
Thái Lan |
40 |
Bảng 2. Giá thành cho bảo quản
mỗi chủng vi sinh vật hàng năm
3.6. Bảo quản các chủng có giá
trị:
Đối với các chủng vi
sinh vật có giá trị thì tuỳ theo yêu cầu mà cần thực
hiện nhiều phương pháp khác nhau cũng như bảo quản
tại các nơi khác nhau để hạn chế khả năng mất các
đặc tính quý cũng như mất chủng do những rủi ro ngẫu
nhiên (cháy nổ, động đất, chiến tranh v.v..).
3.7. Cung cấp chủng giống cho
khách hàng:
Đối với các chủng cần
cung cấp nhiều cho khách hàng (hoặc các chủng cần
cho nghiên cứu thường xuyên) thì cần phải bảo quản
với số lượng lớn với phương pháp thích hợp cho việc
vận chuyển đến khách hàng.
3.8. Cung cấp các thông tin liên
quan đến chủng bảo quản:
Chất lượng của Bộ sưu
tập giống liên quan đến các số liệu, thông tin về
từng chủng vi sinh vật bảo quản. Do đó, nhu cầu
nghiên cứu để thu nhận các thông tin cần thiết cung
cấp cho khách hàng là rất quan trọng.
3.9. Kiểm tra chất lượng chủng vi
sinh vật bảo quản:
Các chủng của Bộ sưu tập
vi sinh vật cần phải tuân theo các qui định nghiêm
ngặt kiểm tra định kỳ theo từng thời gian bảo quản
như tỷ lệ sống sót, mức tạp nhiễm, thay đổi đặc tính
di truyền như dấu chuẩn di truyền, sự tồn tại của
plasmid, đặc điểm phân loại, khả năng sinh các chất
có hoạt tính sinh học…Một trong các cách đánh giá
khả năng sống sót của chủng vi sinh vật bảo quản là
dựa theo phương trình sau:
t = 8Log(So/Log So-Log Sac)
Trong đó: t - Thời gian của
mẫu bảo quản trong ampoule.
So -
Số lượng tế bào sống sót ngay sau khi bảo quản.
Sac
- Số lượng tế bào sống sót ngay sau khi tiến hành
thí nghiệm.
3.10. Cơ sở dữ liệu của Bộ sưu
tập vi sinh vật:
Ngày nay, khi tin học là lĩnh vực xâm nhập và làm
thay đổi sâu sắc đến mọi lĩnh vực đời sống thì việc
quản lý Bộ sưu tập vi sinh vật không còn là một
ngoại lệ. Người ta đã ứng dụng các phần mềm máy tính
phù hợp để quản lý các chủng vi sinh vật bảo quản,
các thông tin liên quan cũng như chương trình kiểm
tra chất lượng định kỳ. Sử dụng tin học là công việc
có tiện ích lớn, nó giúp cho người quản lý nắm bắt
được toàn bộ thông tin cũng như lý lịch của các
chủng vi sinh vật và dễ dàng tra cứu, làm báo cáo
khoa học theo các tiêu chí riêng. Nói chung với các
bộ sưu tập có số lượng vi sinh vật không lớn thì có
thể sử dụng phần mềm: Microsoft Access, Access
Visual Basic.
4. Giới thiệu chung về một số
phương pháp bảo quản vi sinh vật:
Trong phần này chúng tôi mô
tả các phương pháp được dùng chung cho các đối tượng
vi sinh vật chính (vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, xạ
khuẩn, vi tảo).
4.1. Phương pháp cấy truyền vi
sinh vật:


Hình 1. Bảo quản bằng phương pháp
cấy truyền trên môi trường thạch
Đây là phương pháp bảo quản
đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi
trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống
nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích
hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi
sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt
độ thích hợp. Quá trình này được lặp lại trong một
thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn
được chuyển đến môi trường mới trước khi già và
chết. Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp
với phương pháp bảo quản này như: Staphylococi,
Coliform... có thể sống được vài năm theo
cách này. Cho dù phương pháp này là phương pháp khá
phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử
dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng
đang dùng cho nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này
cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:
-
Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống
gốc.
-
Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng
trong quá trình bảo quản.
-
Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy
truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản.
-
Tốn nhiều công sức để cấy truyền.
-
Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi
trường cấy truyền không thích hợp.
-
Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi
các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi
lần cấy truyền.
* Phương pháp làm mất nước trong môi
trường bảo quản:
Phương pháp này thường dùng cho các
chủng nấm sợi và nấm men. Theo phương pháp này các
chủng vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất
mang phổ biến như sau:
a.
Trên đất, cát và silicagel. Các nghiên cứu
cho thấy là bào tử nấm có thể sống 4-5 năm khi bị
làm khô trong đất mà không bị thay đổi các đặc tính
sinh học. Ngày nay silicagel là chất mang được dùng
phổ biến và có hiệu quả đối với bảo quản nấm men,
nấm sợi.
b.
Bảo quản trên giấy: Các chủng nấm men và nấm
sợi được làm khô trên giấy và sau đó được bọc bằng
giấy bạc và đựng trong hộp kín. Ưu thế của phương
pháp này là bảo quản được lượng mẫu lớn.
c.
Bảo quản trên gelatin: Để thực hiện phương
pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh
vật trong môi trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu
được làm khô trong đĩa petri. Phương pháp này có thể
bảo quản được vi khuẩn trong vài năm.
Nhìn chung, không có phương pháp nào
là vạn năng cho bảo quản các nhóm vi sinh vật khác
nhau. Thực ra là rất khó khi đánh giá một cách đầy
đủ xét theo mọi yêu cầu đã được đặt ra ở trên. Chính
vì vậy mà các phương pháp bảo quản phải được kiểm
nghiệm thực tế với từng loại vi sinh vật, từ kết quả
đó có thể chọn ra phương pháp thích hợp hoặc đồng
thời sử dụng các phương pháp khác nhau.
4.2. Phương pháp đông khô vi sinh
vật và phương pháp đông khô trực tiếp:
a. Phương pháp đông khô:

Hình 2. Đông khô vi sinh vật.
Đông khô là quá trình mà nước được
lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh
sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi
trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường
chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối
cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được
hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không.
Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo
quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm
sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên,
phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động
vật nguyên sinh và tế bào động vật.
b. Phương pháp đông khô dịch thể
trực tiếp (L-drying):
Ngoài phương pháp đông khô như mô tả
ở trên, còn có phương pháp đông khô trực tiếp. Khác
biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi
sinh vật được làm khô nhanh ở chế độ chân không
thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước. Phương
pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn
không có khả năng sống trong nhiệt độ thấp của giai
đoạn tiền đông. Các thông số quan trọng cần được
quan tâm khi thực hiện phương pháp này là:
-
Tuổi của vi sinh vật bảo quản.
-
Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật.
-
Tốc độ đông khô.
-
Nhiệt độ đông khô thấp nhất.
-
Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối
cùng của mẫu.
Phương pháp này nhanh và thuận lợi
cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu. Thông thường
theo phương pháp này vi sinh vật được bảo quản từ
10-20 năm. Nói chung cả hai phương pháp này có nhiều
ưu điểm so với các phương pháp trước như thời gian
bảo quản lâu, tiết kiệm được công sức và sai sót
nhãn mác và tạp nhiễm. Tuy nhiên, nhược điểm lớn
nhất của phương pháp này là giá thành thiết bị. Độ
ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các
đợt đông khô là khác nhau. Hơn thế nữa các chủng
trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi
trường thích hợp một số lần để phục hồi các đặc tính
sinh học.
4.3. Phương pháp bảo quản lạnh
sâu:
Đối với phương pháp bảo
quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong
môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống
của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu
(-196°C -> -80 °C).

Hình 3. Bảo quản lạnh
sâu
Với phương pháp này, tế bào có thể
bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một
nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ
các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành
các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược
điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế
tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO
(dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp
lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ
khác nhau như -20° C, -30° C,
-40° C, -70° C, -140°C
và -196° C. Nói chung mức nhiệt độ
cao hơn -30°
C
cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao
sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản
này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau
như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut.
Đặc biệt với phương pháp
bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn
năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối
tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi,
nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật.
Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược
điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ
lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ... Đặc biệt phương pháp
này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường
xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường
được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc
tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông
khô.


Hình 4. Bảo quản trong nitơ lỏng.
5. Một số phương pháp phổ biến
sử dụng trong bảo quản các nhóm vi sinh vật cụ thể:
Trong phần này chúng tôi giới thiệu
cụ thể một số phương pháp thông dụng nhất.
5.1. Các phương pháp dùng cho bảo
quản vi khuẩn và xạ khuẩn:
Bảo quản vi khuẩn:
a.
Phương pháp đông khô (Freeze drying/
lyophilization):
Đây là phương pháp phổ biến được sử
dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới.
Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các
đặc tính của vi sinh vật và bảo quản được trong một
thời gian dài.
Phương pháp đông khô được trình bày
ở đây là phương pháp được dùng tại NCTC (National
Colleciton Type Culture, Anh).
1, Nuôi vi khuẩn cho đông
khô:
Vi khuẩn được cấy trên môi trường
ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể
chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể
nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của
tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào
nằm trong pha sinh trưởng log.
2, Chuẩn bị đệm mẫu:
Có thể dùng một trong hai
loại đệm sau:
+ Đệm huyết thanh-
inositol;
Meso-inositol: 5 gam
Huyết thanh ngựa
(số 3): 100 ml
Thanh trùng bằng
phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào các
bình vô trùng.
+ Đệm inositol:
Môi trường dinh dưỡng bột
số 2: 2.5 gam
Meso-inositol: 5 gam
Nước cất: đủ 100 ml.
Phân 5 ml vào các bình và
khử trùng tại nhiệt độ 121OC.
3, Chuẩn bị dịch tế bào:
Mật độ tế bào có ý nghĩa
quan trọng đối với chất lượng bảo quản. Thông thường
có thể thu sinh khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ
dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế
bào. Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010
(đối với vi sinh vật không có bào tử). Mật độ trên
có thể giảm với các vi sinh vật có bào tử. Hai đệm
pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng
trong trường hợp enterobacteria thì không dùng đệm
huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn dịch
của vi khuẩn.
4, Chuẩn bị ống đông khô:
Ống đông khô được rửa sạch
sau đó ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) và
lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống
được thanh trùng khô hoặc khử trùng theo phương pháp
thông thường.
5, Chuẩn bị mẫu trước khi
đông khô:
Lượng dịch huyền phù vi
khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet pasteur vào ống
đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml. Chú ý mọi thao tác phải
cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía trên của
ống đông khô.
6, Bước tiền đông khô:
Mục tiêu của bước này là
làm bay hơi hết nước có thể bị lạnh đông tạo đá.
Trước khi tiến hành đông khô mẫu được chuẩn bị qua
bước tiền đông (như trình bày ở trên) sau đó bước
tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ
thống đông khô và quá trình làm mất nước trong điều
kiện lạnh được tiến hành khoảng 3 giờ.
7, Tạo chỗ thắt trên ống
đông khô:
Sau bước tiền đông khô, yêu
cầu phải tạo vết thắt. Việc tạo vết thắt được thực
hiện với hệ thống đèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay các
cơ sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn và
tạo vết thắt trên thiết bị tự động.
8, Hậu đông khô:
Trong bước này mẫu lại tiếp
tục được làm khô cho đến độ ẩm cuối cùng đạt khoảng
1%. Thời gian cho bước này có thể thay đổi từ 1-2
giờ.
9, Hàn ống đông khô:
Việc hàn ống trực tiếp trên
thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm và
cẩn thận. Trước hết phải tiến hành khoá van và sau
đó mới thực hiện thao tác hàn ống đông khô.
10, Kiểm tra độ chân không
của ống đông khô:
Người ta sử dụng thiết bị
là đèn phát hiện mức độ chân không. Với các mẫu đạt
độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím
nhạt. Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không
có tín hiệu hoặc màu tím đậm.
11, Kiểm tra khả năng sống
của mẫu:
Đếm số lượng tế bào là
phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản.
Việc đếm được thực hiện trước khi và ngay sau khi
đông khô. Các bước kiểm tra tiếp theo có thể được
thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượng
của mẫu đông khô. Nói chung khả năng sống của vi
sinh vật có bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào
tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm.
Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì yêu cầu phải
được tiến hành theo đúng qui trình, tránh vi sinh
vật tiếp xúc với oxy.
12, Bảo quản mẫu:
Mẫu thông thường được bảo
quản tại 4OC hay nhiệt độ phòng.
b.
Phương pháp giữ trong lạnh sâu:
1, Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu:
Tế bào được nuôi cấy trên
môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc
đầu pha log.
2, Pha dịch tế bào với
glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt nồng
độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106.
3, Dịch huyền phù tế bào
được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường
hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh
metylene 0.05% để phát hiện các ống bị rò rỉ).
Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ
phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm
thấu trong và ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ
lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng.
Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng
cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc độ lạnh
dao động 1-3 OC/phút để đạt tới nhiệt độ
-30OC ban đầu. Sau đó mẫu được làm lạnh
tiếp với tốc độ cao hơn 10-15 OC/phút để
đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100OC
đến -80 OC). Hiện nay, đã có các thiết bị
làm lạnh sâu được chương trình hoá với tốc độ mong
muốn. Tuy nhiên, cũng có thể đơn giản hơn là mẫu ban
đầu được đặt trong đá khô sau đó lại đưa vào tủ lạnh
sâu và đặt thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ -65OC.
4, Hoạt hoá mẫu: mẫu trong
lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá bằng
cách làm tan nhanh tới mức có thể (thông thường đưa
ngay vào tủ ấm 37 OC trong 40-60 giây).
Như vậy, theo cách trên có thể đạt được khả năng
sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản.
c. Một số phương pháp
bảo quản khác: Bảo quản trên gelatin và
silicagel.
Bảo quản xạ khuẩn:
Xạ khuẩn mang cả đặc tính của vi
khuẩn và nấm sợi (có sợi và bào tử) do đó cần có
những phương pháp bảo quản thích hợp.
Thông thường xạ khuẩn cũng được bảo
quản theo các cách thông thường như cấy truyền, đông
khô và lạnh sâu như với vi khuẩn ở trên. Tuy nhiên,
có phương pháp kinh tế mà vẫn đảm bảo chất lượng
chủng bảo quản mà chúng tôi trình bày ở đây, đó là
phương pháp bảo quản trong đất.
Các bước tiến hành bảo quản
trong đất:
1, Chuẩn bị đất: lấy đất
vườn làm khô tại 150 OC trong 6 giờ để
làm chết các vi sinh vật có bào tử và trứng giun nếu
có. Đất sau khi thanh trùng được nghiền nhỏ qua lưới
có kích thước 30 mesh. Đất sau khi nghiền được đưa
vào ống nghiệm chuẩn bị nút bông và thanh trùng
trong 60 phút. Trước khi tiến hành bảo quản phải
kiểm tra nhiễm sự khuẩn trong đất bằng cách cấy vòng
que cấy đất từ ống nghiệm đặt vào môi trường giàu
dinh dưỡng cho vi khuẩn và giữ ở 24 OC,
28 OC và 37 OC, kiểm tra sau
2-4 ngày.
2, Chuẩn bị dịch huyền phù
xạ khuẩn. Nước cất vô trùng được dùng để tạo dịch
huyền phù xạ khuẩn (hay bào tử xạ khuẩn) từ ống
thạch nghiêng. Lấy 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi
ống nghiệm và để khô tại nhiệt độ phòng (24OC)
trong thời gian 1 tháng. Đập nhẹ vào thành ống cho
các hạt tách đều ra và bảo quản mẫu tại 4OC.
3, Hoạt hoá mẫu đơn giản
bằng cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường
(thạch hoặc dịch thể) và để ở nhiệt độ thích hợp.
5.2. Bảo quản vi tảo:
Vi tảo thông thường được
bảo quản theo 3 phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu và
đông khô. Các phương pháp đã được trình bày chi tiết
trong phần vi khuẩn. Một số điểm cần chú ý khi bảo
quản vi tảo là ở chỗ: Nên dùng tế bào già ở pha cân
bằng, phương pháp lạnh sâu cho kết quả tốt hơn
phương pháp đông khô.
5.3. Các phương pháp dùng cho bảo
quản nấm sợi:
a. Phương pháp cấy
truyền:
Phương pháp này thường được
ứng dụng với các sợi nấm có bào tử. Các chủng nấm
sợi được nuôi trên môi trường thạch thích hợp và để
cho sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau đó là
quá trình hình thành bào tử, các ống giống này sẽ
được bảo quản theo các cách khác nhau:
-
Các ống thạch được để trong tủ lạnh (4-7
OC).
-
Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống
thạch được bảo quản dưới lớp dầu parafin có tỷ trọng
tương đối là 0.83- 0.89 đã được khử trùng ở nhiệt độ
121 OC trong 15 phút. Lớp dầu cách bề mặt
thạch khoảng 1 cm. Nhiệt độ bảo quản là 15-20 OC.
-
Bảo quản trong nước, nấm sợi được nuôi trên
môi trường thạch đĩa. Sau khi sợi phát triển cực đại
thì cắt thành từng miếng nhỏ kích thước khoảng
6 mm2 và
cho vào lọ nước đã thanh trùng. Bảo quản tại nhiệt
độ phòng.
b.
Bảo quản nấm sợi có bào tử trong silicagel:
Chuẩn bị:
1, Lọ đựng silicagel (10-15ml) có
nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) thanh trùng ở nhiệt độ
170 OC trong 3 giờ.
2, Silicagel: Loại trong suốt, không
có màu, kích thước và số lượng hạt silicagel đưa vào
không quá 1/3 thể tích của lọ, thanh trùng ở nhiệt
độ 170 °C trong 3 giờ.
3, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk)
20% khử trùng ướt (115OC/20 phút).
4, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa
petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng, môi
trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp
khác nhau (10-15 ngày).
Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4
ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử
nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có
mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng
bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài
ống thạch bào tử khác nhau).
2, Dùng pipet pasteur lấy
dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel. Chú ý
silicagel hút nước và sinh nhiệt do đó việc đưa dịch
bào tử vào phải được thực hiện trong chậu nước đá.
Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt quá 1/3 thể
tích hạt silicagel trong lọ. Sau đó dùng tay lắc đều
đảm bảo các hạt silicagel đều dính dịch bào tử nấm
sợi. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã
chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích
hợp...
3, Lọ silicagel được đậy
nắp cẩn thận nhưng không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau
đó giữ trong bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25OC
trong 1 tuần. Vặn chặt nút và quấn giấy parafil giữ
trong 4OC.
Kiểm tra độ sống sót sau
khi bảo quản:
Mẫu silicagel ở 4 °C,
dùng que cấy vô trùng lấy ra 3 hạt silicagel để trên
mặt thạch môi trường mầm thóc (Maltagar), lắc đều
cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường. Để ở
nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo
thời gian thích hợp.
c.
Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp
đông khô (freez-drying):
Chuẩn bị:
1, Ống đông khô rửa sạch
(sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170OC
trong 3 giờ.
2, Môi trường sữa tách bơ
(Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20
phút).
3, Ống thạch nghiêng (có
thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng
chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử
thích hợp khác nhau (10-15 ngày).
Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4
ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử
nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có
mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng
bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài
ống thạch bào tử khác nhau).
2, Dùng pipet pasteur lấy
dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 - 0,3 ml),
thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng. Dán
nhãn, ghi các thông tin cần thiết như mã số chủng,
ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau
đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc.
3, Giữ ở -80°C
trong 3 giờ trước khi tiến hành đông khô, đồng thời
bật máy Dura-Stop, khi nhiệt độ đạt -40OC,
đưa mẫu vào tủ đông khô của Dura-Stop, bật máy
Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor,
nhiệt độ -55OC, tăng nhiệt độ Dura-Stop
lên -5OC, để qua đêm.
4, Tăng nhiệt độ Dura-Stop
lên 25°C, khi đạt nhiệt độ cần thiết, tắt
máy hút chân không nhưng không tắt Dura-Dry.
5, Tắt Dura-Stop, lần lượt
nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy
Dura-Dry, tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt
45-48 minitor, nhiệt độ -55OC.
Chú ý: Trong trường hợp chỉ
dùng Dura-Dry có thể được thực hiện như sau:
-
Tiến hành các bước 1,2,3,4 như trên.
-
Mẫu được để tiền đông khô ở -80°C
trong 3 giờ. Bật máy Dura-Dry, khi đạt nhiệt độ -60oC
đến -55oC, độ chân không 45 minitor, gắn
ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống khi
độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC.
Kiểm tra độ sống sót sau khi đông
khô:
1, Mở ống đông khô bằng
cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làm lạnh đột
ngột bằng cồn đốt.
2, Dùng pipet pasteur lấy
khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8
ml nước cất vô trùng làm tan đều mẫu đông khô. Hút
toàn bộ dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml
nước cất. Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí khác nhau
(mỗi vị trí 3 giọt) trên môi trường thạch đĩa thích
hợp và nghiêng cho dịch chảy đều dọc theo một hướng
như hình vẽ:

3, Sau đó đậy nắp đĩa, bao quanh bằng parafil và để
ở nhiệt độ thích hợp.
4, Cách đánh giá:
Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc.
Khá: 50 – 100 khuẩn
lạc.
Trung bình: 10-50 khuẩn
lạc.
Kém: < 10 khuẩn lạc.
Không mọc.
Bảo quản được thực hiện
với các mẫu từ khá trở lên. Tuy nhiên, có một số nấm
sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan thì có thể đánh giá
như sau: Nếu các khuẩn lạc mọc đều khắp trên bề mặt
đĩa là tốt. Mẻ đông khô là thành công nếu như số
khuẩn lạc mọc chiếm ít nhất là nửa bề mặt môi trường
trong đĩa petri. Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc
dưới mức trên phải làm tăng mật độ bào tử trước khi
đông khô như thay đổi môi trường sinh bào tử, hoặc
chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào
tử nấm sợi.
d.
Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp đông khô
trực tiếp:
Phương pháp đông khô trực tiếp thực
hiện tương tự như phương pháp đông khô đã trình bày
ở trên và được thực hiện như sau:
Chuẩn bị:
1, Ống đông khô rửa sạch (sonic
cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170oC
trong 3 giờ.
2, Môi trường L-drying chuẩn có
thành phần như sau:
Đệm phosphat: 0.1M : 100
ml.
Monosodium glutamat: 3 g
Adonitol: 1.5 g.
(Khử trùng ở 115oC/20
phút).
3, Ống thạch nghiêng (có
thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng
chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử
thích hợp khác nhau (10-15 ngày).
Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur lấy
khoảng 3-4 ml môi trường đã thanh trùng ở trên cho
vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo
dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao nhất (đối
với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể
tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác
nhau).
2, Dùng pipet pasteur lấy
dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông
thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng, dán nhãn, ghi
các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo
quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy
bằng nút bông hay giấy bạc.
3, Đồng thời bật máy
Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor,
nhiệt độ -75oC, lần lượt nối ampoule mẫu
vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không khi
nối ampoule mẫu với tube manifold sau đó lại mở ra,
để đảm bảo độ chân không cần thiết khi làm đông khô
phải lần lượt đưa mẫu vào khi tín hiệu đèn chỉ thị
cho phép). Khi độ chân không đạt 45-48 minitor,
nhiệt độ -55oC tiến hành quá trình làm
khô trong 3 giờ.
4, Hàn kín ampoule mẫu:
Khi máy cô Dura-Dry đang
chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, lần lượt
khoá van cho từng ampoule mẫu và tiến hành hàn với
các mẫu này tại vị trí ống bị thắt. Dùng ngọn lửa
gas để đốt nóng phần ống thắt cho đều các phía và
xoay đều cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống. Sau đó dùng
ngọn lửa gas để cắt rời phần trên (nối với manifold)
và phần dưới chứa mẫu. Hết đợt lại khoá các van của
các ampoule mẫu tiếp theo và hàn lần lượt như trên.
Kiểm tra chất lượng ngay
sau khi bảo quản:
-
Để kiểm tra độ sống sót của mẫu nấm sợi bảo
quản, có thể thực hiện theo cách đã được mô tả ở
phần đông khô.
-
Kiểm tra độ thuần chủng: các mẫu được cấy
trên môi trường thích hợp và quan sát hình thái và
các đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh
giá khả năng tạp nhiễm và đặc tính sinh học.
-
Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản:
các mẫu sau đông khô trực tiếp được giữ ở 37oC
trong 2 tuần. Độ sống sót của mẫu bảo quản giảm
trong 2 tuần ở 37oC tương đương với bảo
quản 10 năm ở 4oC.
e. Bảo quản nấm sợi bằng phương
pháp lạnh sâu -80 oC và nitơ lỏng (-196
oC):
Chuẩn bị:
1, Chuẩn bị dung dịch glycerol 10%
(3 ml trong ống nghiệm) khử trùng ở 121 oC
trong 15 phút. Ống nhựa nút xoáy (2 ml), rửa sạch
trong sonic cleaner, khử trùng ở 170 oC
trong 3 giờ.
2, Chuẩn bị mẫu nấm sợi
trên môi trường thạch đĩa có lượng bào tử lớn.
Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur hút
khoảng 0,3 ml glycerol đã thanh trùng vào ống nhựa
đựng mẫu. Sau đó dùng dao vô trùng cắt lấy 1 miếng
nhỏ môi trường chứa cả sợi và bào tử nấm sợi cho vào
ống nhựa. Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch
mẫu, đậy nút và bao băng parafil sau đó dán nhãn.
2, Mẫu trước tiên phải để ở
5oC (tạo điều kiện cho glycerol đi vào tế
bào), sau đó được làm lạnh sâu tử 25oC
xuống -55oC với tốc độ -1oC/phút.
Trong trường hợp không có thiết bị làm lạnh thì có
thể để -20oC trong 3 giờ, sau đó chuyển
sang -80oC hay nitơ lỏng (-196oC).
Chú ý: Việc bảo quản
theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết các
nấm sợi sinh bào tử và tế bào có vách ngăn. Nhưng
phương pháp này tỏ ra không thích hợp với các nấm
sợi không sinh bào tử và không có vách ngăn. Trong
trường hợp này cần nuôi cấy nấm sợi trên môi trường
thích hợp để tạo bào tử. Nếu không khắc phục được
thì phải tiến hành nuôi trên môi trường dịch thể để
thu lấy sinh khối và giữ trong glycerol 10% như
trên.
Đánh giá khả năng sống
của mẫu bảo quản:
1, Làm tan mẫu (mẫu lấy từ
tủ lạnh sâu -80oC hoặc nitơ lỏng -196oC)
trong bể ổn nhiệt 37oC trong 2 phút.
2, Dùng que cấy lấy các
miếng môi trường thạch đặt vào 3 vị trí khác nhau
trên môi trường thạch đĩa thích hợp. Để ở nhiệt độ
thích hợp và xem khả năng mọc sau thời gian thích
hợp (2-4 ngày). Chú ý khi lấy mẫu cần lấy cả sợi nấm
để đưa vào môi trường thạch đĩa.
Một số điều chú ý đối
với bảo quản nấm sợi:
-
Ảnh hưởng của ánh sáng với quá trình hình
thành bào tử: Phần lớn trường hợp thì sự thành công
của phương pháp bảo quản phụ thuộc vào số lượng bào
tử. Ánh sáng là một tác nhân quan trọng đối với quá
trình hình thành bào tử của nấm sợi, ánh sáng có
bước sóng ngắn có tác dụng kích thích quá trình hình
thành bào tử, ánh sáng gần vùng cực tím (3100 – 4000
nm) có tác dụng thay đổi màu sắc và kích thước khuẩn
lạc.
-
Thành phần môi trường: Nói chung các môi
trường có thành phần dinh dưỡng nghèo thì thường cho
lượng bào tử lớn.
-
Tránh nhiễm tạp các con mạt (mite), các chủng
nấm sợi lưu giữ thường bị mạt phá hoại. Đầu tiên
chúng ăn chủng giống và làm hỏng, sau đó gây tạp
nhiễm do mang bào tử và vi khuẩn trên cơ thể từ ống
này sang ống khác. Vì lý do trên mà cần có biện pháp
hạn chế mạt, thông thường các chủng giống phải được
bảo quản ở nơi sạch, nhiệt độ 4-8oC.
5.4. Phương pháp bảo quản nấm
men:
Tương tự như nấm sợi, có
nhiều phương pháp bảo quản nấm men. Chúng tôi chỉ đề
cập đến các phương pháp thông dụng nhất đang được sử
dụng tại các bộ sưu tập nấm men lớn trên thế giới.
a. Phương pháp cấy
truyền:
Cấy truyền là phương pháp
đơn giản, nhanh và rẻ tiền cũng như thông dụng nhất,
tuy nhiên những hạn chế của phương pháp này là dễ
tạp nhiễm cũng như những thay đổi các đặc điểm sinh
học, tính trạng di truyền sẽ là bất lợi khi bảo quản
theo phương pháp này.
Cấy truyền trên môi
trường dịch thể:
-
Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10 ml
môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường là môi
trường YM Yeast extract – Maltose) trong lọ
McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121oC
trong 15 phút. Thường làm 2 lọ cho mỗi chủng bảo
quản.
-
Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản được
đưa vào môi trường bằng thao tác vô trùng và giữ ở
25oC trong 72 giờ. Phải kiểm tra sự phát
triển của chủng bảo quản.
-
Sau đó các mẫu được giữ ở 4oC.
-
Thông thường theo cách này thời gian bảo quản
các chủng thường thay đổi từ 2- 6 tháng.
Cấy truyền trên môi trường
thạch:
Cấy truyền trên môi trường
thạch tương tự như môi trường dịch thể nhưng ở đây
môi trường được bổ sung thạch (1.6%). Giống sau khi
cấy được giữ trong 72 giờ ở nhiệt độ thích hợp để
đạt độ phát triển cần thiết, sau đó được để ở 4-8oC.
Theo phương pháp này giống có thời gian sống lâu hơn
phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống
được bảo quản từ 3-6 tháng.
Thời gian bảo quản có thể
được kéo dài từ 2-3 năm nếu như các ống giống được
bảo quản trong dầu parafil đã thanh trùng và được đổ
lên trên môi trường thạch sao cho tạo một lớp dày
khoảng 1cm.
b. Phương pháp bảo quản
trong lạnh sâu và đông khô (xem phần các phương pháp
dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn).