Bệnh Thiếu Máu do có Hồng Huyết Cầu Lưỡi Liềm

Những bài cùng tác giả

Bệnh Thiếu Máu do có Hồng Huyết Cầu Lưỡi Liềm (Sickle Cell Anemia). Một trường hợp Sử Dụng Công Nghệ Thông Tin Sinh Học Phân Tử trên Mạng để tìm hiểu và phân tích.

Lời nói đầu:

Đây là bài dịch của một bàt tập đăng trên mạng của Biology Workbench dành cho sinh viên sinh hóa thực tập dùng các dữ liệu cùa National Center for Biotechnology Information (NCBI) để nghiên cứu sinh học phân tử, một môn học rất đang được phát triển ngày nay. Bài tập này đã dùng trường hợp của bệnh hồng huyết cầu lưỡi liềm (sickle cell anemia) để tìm hiểu sự biến đổi của gene diễn giải (coding) cho phân tử hemoglobin, chất protein nồng cốt cho hồng huyết cầu, và sự biến đổi này đã là nguyên nhân chính gây ra bệnh này. Bài dịch đã được hai chuyên viên sinh học là Phạm Thanh Phong (phamthanhphong@aim.com) và Cao Xuân Yến (xuanyen611116@gmail.com) dùng mạng Internet kết nối ở Việt Nam để thực nghiệm và chứng minh là bài tập có thể thực hiện được . Mặc dầu có vài sự thay đổi nhỏ trong phiên bản mới của Biology Workbench so với phiên bản đưọc dùng trong bài dịch này, nhưng nó không ảnh hưởng đến kết quả của bài tập. Điều quan trọng là những lời chỉ dẫn và kết qủa có được ở từng giai đoạn viết trong bài tập phải triệt để tuân hành. Riêng phần Protein Explorer (phần VI) đã được thực hiện với Internet Explorer 6. Như đã chỉ dẫn trong bài, phần VI đã dùng thêm phần mềm Chime (tải dùng miễn phí) để thực tập, mặc dầu cũng có dùng phần mềm JMOL. Dịch giả thành thực cám ơn sự đóng góp của hai chuyên viên sinh hóa nói trên.

Giới Thiệu

Sickle cell anemia là bệnh di truyền trong đó bệnh nhân trông rất bình thường ngoại trừ xanh xao thiếu máu do hồng huyết cầu bị xẹp lại trông như lưỡi liềm vậy. Nguyên nhân sự kiện này là do phân tử hemoglobin bị biến đổi (mutation) ở một aminoacid. Phân tử hemoglobin là một protein gồm có 4 xâu polypeptides; hai alpha-globin và hai beta-globin. Phân tử này là thành phần chính của hồng huyết cầu dùng để vận chuyển oxygen (O₂) từ phổi đến các cơ quan khác của cơ thể và trao đổi với than khí carbonic (CO₂), chất thải của dinh dưỡng (Kreb’s Cycle) để đem trở lại phổi. Sự thay đổi của aminoacid xảy ra ở một chuỗi beta-globin làm thay đổi cấu hình (configuration) của phân tử hemoglobin khiến cho phân tử không thể gắn vào oxygen và dẫn đến sự vận chuyển oxygen nói ở trên trở lên vô hiệu quả. Hậu này quả là hồng huyết cầu của bệnh nhân này kết tụ lại thành chùm dây (fibrous threads) và không thể di chuyển qua các mạch máu nhỏ (narrow capillaries) một cách dễ dàng, dẫn đến kết quả là thiếu máu di chuyển đến một phần cơ thể và làm bệnh nhân cảm thấy rất đau đớn.
Bài tập này đặc biệt chú ý đến sự biến đổi (mutation) của hemoglobin, vì do đó là nguyên nhân chính dẫn đến bệnh gây ra sự đau đớn này. Sự thay đổi này bắt đầu từ biến đổi của gene (DNA) mà nó dùng để dẫn giải (coding) cho protein beta-globin. Điều này được giải thích như sau: Từ sự biến đổi một nucleotide trên chuỗi DNA cũng sẽ dẫn đến sự thay đổi của một nucleotide tương ứng trên phân tử mRNA (G-C, A-U). Mỗi bộ 3 nucleotides trên mRNA lập thành một codon mà nó chọn ra một tRNA có codon- Amino-Acid (AA) tương xứng và đặt vào chuỗi AAs (peptide) đang trên đường tạo lập. Nếu một nucleotide trên codon của mRNA bi thay đổi thì nó sẽ dẫn đến chỗ có một AA sai được gắn vào sai vi trí của peptide, và đó là trường hợp của chuỗi beta-globin trong bệnh sickle cell anemia được chọn ra ở đây để thực tập.

Mục đích của bài thực tập này gồm hai phần. Thứ nhất là bạn sẽ học được cách tìm trên internet các dữ liệu (data bases) chứa chấp và sắp xếp các chuỗi DNA hay các chuỗi protein. Bạn sẽ học được cách tìm kiếm, sắp đặt, và thay đổi thứ tự của chuỗi theo ý muốn. Bạn cũng có thể học cách nhìn các phân tử proteins trong không gian 3 chiều dựa trên các proteins mà bạn kiếm được trong các data bases nói trên. Trong phần thứ hai các bạn sẽ dùng các databases nói trên để học về các khía cạnh sinh học phân tử của bệnh sickle cell anemia. Để làm được các việc này chúng ta sẽ dùng hai phần mềm quan trọng gọi là Biology Workbench và Protein Explorer. Phần mềm Biology Workbench được thiết kế để giúp sinh viên tìm kiếm và phân tích các chuỗi DNA hay protein theo ý muốn. Phần mềm protein explorer sẽ giúp nhìn phân tử trong không gian 3 chiều. Các bạn sẽ dùng protein explorer để khảo sát sự biến đổi của beta-globin đã thay đổi hình dạng của phân tử này và dẫn đến bệnh thiếu máu.
 

Phần I:

Ghi danh để sử dụng (mở account) cho Biology Workbench. Muốn vậy, bạn hãy vào trang internet: http://workbench.sdsc.edu. Sau đó, ta sẽ làm ”set up free account” để có được user name và password. Khi ta đã login được rồi thì sẽ thấy trang đầu như sau:

Sau khi kéo đến cuối trang bạn sẽ được chọn mầu nền (background) mà bạn nên chọn lấy mầu hồng để cho xem được rõ ràng sau này. Bạn sẽ bấm chuột vào nút “session tools” để bắt đầu.
Chương trình mới bắt đầu từ trang có các tiêu đề như sau:

Bạn nhấn chuột vào nút “New Session Tools” , sau đó là “Run”.



Bạn tạm đặt tên cho session description là Sickle Cell Anemia và đánh tên này vào ô sau đây:


Sau đó trang Sickle cell anemia xuất hiện. Bạn có thể lựa chọn giữa trang “Default” và trang này. Chú ý là ta luôn luôn về trang Sickle Cell Anemia này trong bài tập.


Trong các phần sau chúng ta sẽ học cách tìm kiếm và phân tích các chuỗi DNA hay protein, rồi nhập chúng vào phần mềm Workbench. Chúng ta dùng chuột bấm vào hộp ô “Nucleic Tools” trên đầu trang để vào chương mục sử dụng nucleic acid tools. Bắt đầu chúng ta thấy ô “empty” hiện ra, chứng tỏ chưa có chuỗi protein nào đã được kết nạp vào. Khi chúng ta nhập một chuỗi qua “cut-past” từ một kho dữ liệu (databases) thì chữ “empty” sẽ biến mất và thay vào đó là những chuỗi DNA mà chúng ta đã muốn kết nạp.

Phần II.

Kết nạp các chuỗi từ “Nucleic Acid Sequence Databases”
Trong phần này chúng ta sẽ học cách nhập các chuỗi DNA từ các kho dữ liệu. Như đã nói ở trên, chúng ta muốn khảo sát “gene” của beta-globin, và đâu là sự biến đổi (mutation) dẫn đến bệnh thiếu máu Sickle Cell Anemia.
Để làm được công việc trên, chúng ta dùng chuột để kéo thư mục tìm kiếm xuống tới hàng chữ “Ndjinn-Multiple Database Search” như hình chỉ dưới đây, rồi bấm vào ô “Run” ở phía dưới.



Trong trang kế tiếp thì có một danh sách các kho dữ liệu mà chúng ta có thể chọn lựa. Trong ô tìm kiếm chúng ta đánh chữ beta-globin và trong ô bên cạnh chúng ta dùng “Show All Hits” để lấy tất cả kết quả tìm được. Sau đó chúng ta bấm vào ô “Search”.



Tiếp đến chúng ta sẽ thấy một trang liệt kê một lô các databases khác nhau, chúng chia ra làm 2 nhóm: Một nhóm gồm các chuỗi DNA của các cơ thể khác nhau (vi dụ GBPHG là kho dữ liệu của các vi khuẩn, GBPLN là kho dữ liệu của thực vật, nấm, và rong biển. Nhóm thứ hai gốm các chuỗi DNA của toàn thể một cơ thể đặc biệt nào đó. Thí dụ “Mthe” là dữ liệu của toàn thể vi trùng Methanobacterium thermoautotrophicum.
Bởi vì ở đây mục đích của chúng ta là tìm các chuỗi DNA (beta-globin gene) cho con người, do đó chúng ta đánh dấu √ vào ô GBPRI (geneBank Primate Sequences)



Bấm chuột lùi xuống để nhìn thấy ô “Search” để bấm vào đây. Bạn sẽ thấy kết quả của sự tìm kiếm hiện ra trong trang này. Ở thời điểm này có ít nhất 293 “hits” do sự tím kiếm của “beta-globin” genes. Số này sẽ thay đổi hàng ngày do các chuyên gia bỏ thêm vào. Từ kết quả này ta biết được thứ tự “nucleotides”của chuỗi DNA trong ‘gene” của beta-globin của người khoẻ mạnh bình thường. Đó là chuỗi “gbprt29436-human messenger rna for beta-globin” (bạn có thể phải kéo chuột xuống để thấy hàng chữ này) .



Bạn hãy nhấn chuột để “highlight” (nét đậm) rồi bấm chuột vào ô “import Sequence(s) ở trong hộp ở cuối trang như sau:



Sau đó thì chuỗi DNA (beta-globin gene) được nhập vào trang “Nucleic Tools” của phần mềm Workbench.

Phần III.

Tìm chuỗi biến đổi (mutant) của beta-globin gene: Dùng phần mềm BLAST.
Như đã nói ở trên, chúng ta đã tìm ra chuỗi DNA của beta-globin trên gene binh thường. Bây giờ chúng ta dùng nó để tìm ra chuôi DNA của beta-globin trong gene bị bệnh thiếu máu Sickle Cell Anemia. Bởi vì chúng ta đã biết hai chuỗi DNA này chỉ khác nhau ở một nucleotide (single base), do đó có thể dủng chuỗi DNA bình thường đã có đễ đi tìm những chuỗi DNA tương tự (homology) với nó. Phần mềm dùng để tìm những chuỗi DNA tương tự được gọi là BLAST.



Hãy kéo chuột xuống tới phần sử dụng gọi là “BLASTN Compare a NS to a NS DB”. (Đây là viết tắt cho “Compare a Nucleic Acid Sequence to a Nucleic Acid Sequence Database”.) và chọn phần này bằng cách nhấn chuột vào đó để nét đậm hiện ra, sau đó để ý rằng ở phần cuối của hộp ô chữ có chữ GBPRI:29436 Human messenger RNA for beta globin với dấu √ ở phía trước. Bấm chuột vào ô nút “Run”. Chúng ta sẽ thấy một trang mới hiện ra trong đó có nhiều sự chọn lựa khác nhau. Trong phạm vi của bài tập này chúng ta chỉ cần để ý đến phần so sánh giữa các chuỗi DNA trong con người, do đó chúng ta bấm chuột vào phần “GenBank Primate Sequences” và sau đó bấm vào nút “Submit”. Sau đó chúng ta sẽ có một trang mới với kết quả hiện ra do sự tím kiếm BLASTN.

Chú ý rằng hàng đầu tiên của kết quả chính là chuỗi mà ta đã bắt đầu hỏi, tức là chuỗi của beta-glodbin của người bình thường. Sau đó là những chuỗi gene tưong đồng gần nhất có diểm số cao (cột score hits). Điểm số mà cao hơn 400 thường chỉ định là sự tương đồng cao. Tuy nhiên, để có kết quả có thể chắc chắn hơn thì chúng ta nhìn sang cột ở bên phải với chỉ số “E value”.

Chỉ số E Value

Chỉ số E (Expect, uớc lượng) là con số dùng để xếp hạng thứ tự ưu tiên trong sự tím kiếm. Chỉ số này thực ra là con số uớc luợng có được do cách tính sác xuất thống kê, nó dựa trên số lần tương đồng giữa các chuỗi nucleotides khi so sánh với nhau, xảy ra một cách ngẫu nhiên và có cùng cỡ (số nucleotide bases, kb) nào đó. Chỉ số E thay đổi từ 0,1 đến 10, với số càng nhỏ thì sự tương đồng càng cao. Chỉ số 0 có nghỉa là hoản toản giống nhau (zero cơ hội giống nhau do sự ngẫu nhiên) . Vậy bây giờ là lúc ta phải quyết định xem chuỗi DNA nào là chuỗi có sự biến đổi so với chuỗi beta-globin bình thường. Như đã nói ở trên, chúng ta biết là sự biến đổi của beta-globin gene này chỉ xảy ra ở một nucleotide (gọi là single point muatation) mà thôi, vì vậy hai chuỗi DNA này phải có sự tương đồng rất cao. Dựa trên kết quả có được từ trang BLASN, chúng ta sẽ dù ng chuôt đêể đ âậ m né t “highlight” một số kết quả có điểm “score hits” cao hay chỉ số E value rất thấp (lẽ dĩ nhiên trừ hàng đầu ra). Sau đó chúng ta dùng chuột nhấn vào nút “Show Records” để có được những kết quả của những chuỗi DNA mà chúng ta đã “highlight”. Chúng ta sẽ nhấn chuột và kéo xuống đến phần “Records” cho đến khi tìm thấy hàng chữ “beta-globin mutant. Chú ý rằng chúng ta muốn tìm sự biến đổi của chuỗi DNA gây ra bệnh Sicklel cell anemia, do đó trong kết quả tìm kiếm có chữ “sickle”, điều này chứng tỏ là đây là chuỗi DNA chúng ta muốn tìm kiếm.

Một khi bạn đã dịnh được mã số của chuỗi gene này rồi thì bạn ghi số này xuống (mã số GBPRI:183944), sau đó bấm vào nút “Back” (trên mạng Internet Explorer) để trở về trang BLASTN với những kết quả của sự tìm kiếm. Bạn sẽ chọn kết quả với hàng chữ “mutant beta-globin” với mã số GBPRI:183944 như đã nói ở trên và bấm chuột vào hàng chữ này (bỏ những hàng chữ khác mà bạn đã chọn (highlight) trước đây. Sau đó bạn dùng chuột để kéo xuống cuối trang và bấm vào nút “Import Sequence(s)”. Chuỗi gene biến đổi của beta-globin sẽ được tải vào trang chủ của “Nucleic Tools”. Bây giờ là thời điểm chúng ta sẽ tìm ra vị trí của nucleotide thay đổi và đã gây ra bệnh thiếu máu và rất đau đớn này.

Phần IV:

Sắp xếp hai chuỗi DNA để so sánh: Sử dụng phần mềm CLUSTALW.

Để so sánh hai chuỗi nucleic acid thì chúng phải được sắp xếp song song trên dưới lẫn nhau. Chúng ta có thể thực hiển được điều này bằng phần mềm CLUSTALW. Sự sắp xếp hai chuỗi song song trên dưới lẫn nhau sẽ dựa trên những đoạn nucleotides giống nhau của hai chuỗi. Phầm mềm Biology Workench sẽ làm công chuyện đó bằng những phương thức toán học để tìm ra những đoạn DNA giống nhau này và tự động sắp xếp chúng song song với nhau theo thứ tự trên dưới mà chúng ta có thể kiểm soát được. Nhờ đó những nucleotide(s) không giống nhau cũng có thề nhìn thấy được và xác định vị trí của sự biến đổi của gene đã xảy ra.

Để phân biệt được các đoạn nucleotides giống nhau hay khác nhau thì phần mềm đã dùng mầu sắc khác nhau để phân biệt, với mầu xanh da trời ở những vùng rất giống nhau hay mầu xanh lá cây cho những vùng hơi khác nhau….

Để làm công việc so sánh chúng ta hãy dùng chuột kéo xuống hộp menu rồi bấm vào hàng chữ “CLUSTALW-Multiple Sequence Alignment”, sau đó chọn hai chuỗi beta-globin với mã số GBPRI:183944 và GBPRI:29436 và bấm nút chuột vào ô “Run"



Một trang mới hiện ra với những sắp xếp thông số có thể chọn lựa được, tuy nhiên chúng ta không cần thay đổi những thông số này, vì vậy hãy dùng chuột bấm vào ô nút “submit”. Công việc này sẽ dẫn đến một trang mới với hai chuỗi nucleic acid sắp xếp song song với nhau.

Trong hai chuỗi hiện ra, thỉnh thỏang chúng ta tìm thấy những chữ “Y” hay “N”. Chữ “Y” có nghĩa là ở chỗ này thì nucleotide có thể là T (thymidine) hay C (cytosine) mà không thể xác định được, còn chữ “N” thì có nghĩa là chỗ này có thể nucleotide là G (guanosine) hay A (adenosine). Trong bài tập này chúng ta không phải để ý đến những chữ này. Chúng ta để ý là trong chuỗi GBPRI:29436 thì nó bắt đầu bằng những hàng dài nucleotides, trong khi chuỗi GBPRI:183944 thì có những (--------) thay vào. Đó là do kết quả của sự sắp xếp cho song song và tương đương giữa hai chuỗi. Chuỗi GBPRI:29436 thì dài hơn chuỗi GBPRI:183944 do đó những (--------) có là do những chỗ trống thêm vào để cho sự sắp xếp được tương đồng giữa hai chuỗi. Như chúng ta cũng thấy là khi hai chuỗi sắp xếp song song thì tất cả những nucleotides của cả hai chuỗi đều có mầu xanh da trời, tức là chúng giống nhau cả, ngọai trừ một nucleotide A (adenosine) đã được thay bằng T (thymidine) ở hàng thứ tám tính từ trên xuống dưới trong “mutant” beta-globin gene của bệnh Sickle Cell Anemia.



 

Phần V:

Phiên dịch từ chuỗi Nucleic Acid (DNA) qua chuỗi Protein tương ứng.

Phần này nên dành riêng cho những sinh viên chuyên môn, đã học qua phần đầu của môn Sinh Hoc Phân Tử, bao gồm những kiến thức về Transcription (Gene phiên dịch), Translation (Protein phiên dịch), Exons, Introns….

Sự biến đổi gene (mutation) do sự thay đổi của một hay nhiều nucleotides trên gene bình thường sẽ đem đến sự biến đổi của chuỗi protein do nó chỉ dẫn để tạo ra. Để tìm ra được aminoacid nào trong chuỗi beta-globin (protein) bị ành hưởng trong bệnh Sickle Cell Anemia, chúng ta cần biết thành phần aminoacid của beta-globin bình thường và của người bệnh. Có hai cách để làm điều đó khi dùng phần mềm Workbench. Trong cách đầu tiên là tìm kiếm thành phần aminoacid của chuỗi beta-globin bình thường và của người bệnh qua sự sử dụng “Protein Tools” thay vì sử dụng “Nucleic Tools” như chúng ta đã làm ở phần trên. Cách thứ hai là chúng ta phiên dịch từ chuổi DNA (nucleic acid) qua chuỗi aminoacid bằng cách dùng dụng cụ gọi là “SIXFRAME”. Dụng cụ này phiên dịch một chuỗi nucleic acid thành SÁU chuỗi aminchuo64is gọi là “Reading Frames”
 

Tại sao lại SÁU (khung đọc) “Reading Frames” khác nhau?
 

Điều đáng nhớ đầu tiên là chuỗi DNA là một chuỗi kép, và bất cứ một biến đồi gene nào trong chuỗi đó thì có thể xảy ra tại một trong hai chuỗi đó, vậy là chuỗi nào? thường ra thì chúng ta không biết được chuổi nào, do đó cả hai đều có thể dự phần diễn dịch sang aminoacids của chuỗi protein. Do đó có sự giải thích là có 2 trong 6 “khung đọc” phải thực hiện. Thế còn 4 khung dọc khác là gì? Điều đáng nhớ thứ hai là cứ bộ 3 nucleotides (bases) trong mRNA thì được dùng để “đọc” sang một aminoacid, cũng tương với 3 bases trên chuỗi DNA. Thế nhưng đâu là nucleotide để bắt đầu cho sự diễn dịch đó? Một lần nữa, chúng ta cũng không biết đâu sẽ là điểm khởi đầu trên mRNA, do đó chúng ta phải đọc trên cả chuỗi mRNA. Hơn nữa, sự diễn dịch trên mRNA sẽ là từng bộ ba “bases” đơn vị một và vị trí base ban đầu sự diễn dịch đó trên mRNA lại không được biết, do đó toàn bộ mRNA phải được diễn dịch bắt đầu từ ba vị trí đọc “reading frames” khác nhau trên mRNA.

Lấy ví dụ của chuỗi mRNA sau đây, sẽ có ba vị trí đọc khung (reading frames) khác nhau tùy theo điểm đọc ban đầu bắt đầu từ base đầu A, base thứ hai A, hay base đầu U.


Mỗi chuỗi kép DNA có hai chuỗi đơn, mỗi chuỗi chuỗi đơn sẽ được diễn dịch ra một chuỗi đơn mRNA, mà mỗi chuỗi đơn mRNA sẽ có 3 khung đọc “reading frames”, chính vậy với mỗi chuỗi kép DNA chúng ta có tổng cộng tới sáu khung đọc khác nhau. Tuy nhiên trong bài tập ở đây thì chùng ta đã biết chuỗi mRNA của cả gene bình thường và “mutant”, do đó chúng ta chỉ cần 3 khung đọc cho mỗi chuỗi mRNA.
 

Phiên dịch chuỗi Beta-Globin mRNA bình thường.
 

Chúng ta dùng chuột chọn chuỗi beta-globin bình thường (GBPRI:29436) rồi kéo xuống hàng “SIXFRAME-Generate & Import 6 Frames Translation on a NS”, nhấn chuột vào hàng này rồi bấm vào nút “Run”

Trong trang kế tiếp chúng ta sẽ thấy hộp “Translation Parameters” mà chúng ta có thể lựa chọn khung đọc nào mà chúng ta muốn chế tạo. Trong hộp “Frame to Translate” chúng ta chọn bấm chuột vào hàng chữ “3 Forward Frames”, sau đó vào hàng chữ “show sequench (or fragment) being translated”.


Với sự chọn lựa này, phần mềm Workbench sẽ phiên chép chuỗi mRNA thành 3 tập thể khung đọc khác nhau. Bấm chuột vào nút “Submit”. Sau đó quyết định là ở bạn để chọn khung đọc nào là khung đọc đúng.
 

Cách tìm khung đọc đúng.
 

Chúng ta đã có trang với 3 khung đọc khác nhau (đánh số từ 1 đến 3). Tương đối khá dễ để tìm ra khung đọc nào là khung đúng. Bước đầu tiên là phải tìm ra có bao nhiêu điểm dừng (stop codons) trong mỗi khung. Những điểm dừng này được đánh dấu bằng ngôi sao (*) ở bên cạnh của base đó. Khung đọc đúng sẽ là khung có chứa một chuỗi dài aminoacid mà không có điểm dừng. Hãy nhìn đến từng chuỗi sau đây:

Như bạn đã thấy khung đọc số 1 có tới 7 điểm dừng rải rác dọc theo chuỗi. Do đó, chuỗi này không thể là khung đọc đúng được. Khung đọc số 2 có tới hai lần nhiều hơn (14) số điểm dừng, như vậy nó cũng không thể là khung đọc đúng được. Như vậy, chỉ có khung đọc thứ ba là khung đọc dúng thôi. Chúng ta hãy bãi bỏ hai khung đọc số 1 và 2 bằng cách xóa bỏ dấu √ trên hàng đầu của khung. Sau đó dùng chuột kéo xuống hàng cuối của trang và bấm trên hang chữ “Import Sequences”. Điều làm này sẽ nhập chuỗi aminoacid của khung số 3 vào ngân hàng “Protein Tool” của phần mềm Workbench.
 

Diễn dịch chuỗi biến đổi (mutant) beta-globin mRNA.
 

Chúng ta hãy trở lại trang chủ Nucleic Acid có chứa chuỗi mRNA của beta-globin biến đổi. Dùng chuột bấm vào nút “Nucleic Tools” ở phía trên cùng của trang chủ Protein Tools. Hãy chọn chuỗi biến đổi beta-globin (GBPRI:183944) và theo thứ tự sau đây như ta đã làm để diễn giải cho chuỗi beta-globin bình thường.

Bấm nét đậm (highlight) cho hàng chữ “SIXFRAME – Generate & Import 6 Frame Translation on a NS”.

Bấm chuột vào nút “Run”.
Bấm nét đậm vào hàng “3 Forward Frames” trong hộp “Translation Parameters”.
Bấm chuột vào nút “Show sequence (or fragment) being translated”
Bấm nút “Submit”.

Một lần nữa, bạn sẽ thấy 3 khung đọc khác nhau.. Diều các bạn cũng sẽ thấy là có những nucleotides “X” xuất hiện, thêm vào những nucleotides “Y” và “N” đã nói trước đây. Nucleotides “X” có nghĩa là đây là nucleotides không được định rõ. Một khi bạn đã định được rõ đâu là khung đọc đúng (correct reading frames) thì bạn bãi bỏ (deselect) các khung đọc không đúng kia đi, rồi bấm vào nút “Import Sequences”
 

Sự sử dụng dụng cụ sắp xếp song song (alignment tools) để xác định vị trí biến đổi đã gây ra bệnh thiếu máu lưỡi liềm.
 

1) Trở lại trang chủ Protein Tools mà bạn đã nhập hai khung đọc do diễn dịch được từ Nucleic Tools (frames 1 và 3). Bây giờ là lúc chúng ta so sánh hai chuỗi beta-globin bình thường và biến đổi để xác định đâu là aminoacid đã gây ra bệnh Sickle Cell Anemia. Tuy nhiên, để làm được việc này chúng ta phải sửa đổi đôi chút chuỗi aminoacids có được từ sự kết nạp từ dụng cụ “SIXFRAME”. Trong trạng thái có được từ sự kết nạp này thì chuỗi diên giải không dùng thẳng ngay được bởi vì dụng cụ dùng để sắp sếp song song không nhận xét ra được dấu hiệu dừng (*) có trong chuỗi này, do đó (*) phải được xóa đi.

2) Chọn chuỗi diễn dịch có được trong trang chủ Protein và nhấn chuột vào hàng chữ “Edit Protein Sequence(s).

3) Bây giờ thì cả hai chuỗi aminoacids được hiện ra trong trang “Edit”. Tất cà các chuỗi protein thì sẽ bắt đầu bằng aminoacid Methionine (M), vì vậy chúng ta bắt đầu bằng tìm đến aminoacid M bắt đầu này. Làm sao ta có thể làm được điều đó? Chúng ta biết rằng M bắt đầu là aminoacid tiếp theo bởi nhiều aminoacids không bị cắt đứt bởi diểm dừng (*). Lấy ví dụ như trong khung 3, sáu aminoacids sau điểm dừng thứ hai thí co một Methionine (M) theo sau là một chuỗi dài aminoacids mà không đứt quãng.

4)Sau khi bạn đã xác định được M bắt đầu rồi, bấm chuột vào khung có M này rồi chèn (insert) vào một vài khoảng trống (spaces) ở giữa M và aminoacid đằng trước M này (như trong khung đọc 3 (Frame 3) thì chuỗi ICF*HNCVH*QPQTDT đứng đằng trước M bắt đầu). Bấm chuột để đánh đậm nét hàng chuỗi aminoacids (peptide) này rồi dùng delete key trong bàn máy vi tính để xóa bỏ hàng aminoacids này.

5) Bước kế tiếp là xác định đâu là chuỗi cuối của protein diễn dịch . Điều này sẽ được xác định bởi điểm dừng thứ nhất sau M bắt đầu, đó là điểm dừng nằm trên hàng thứ ba của chuỗi aminoacid trong khung. Cũng như vậy, chúng ta tách rời chuỗi này (tất cả aminoacids đằng trước điểm dừng) ra khỏi nhóm bằng cách xóa bỏ phần đuôi (như đã làm với phần đầu) như hình chỉ dẫn sau đây.

Sau đây là tóm tắt của vài bước sau này: những chuỗi aminoacids có mầu xanh là những đoạn phải cắt bỏ, chuỗi đỏ còn lại sẽ là chuỗi protein diễn giải ra từ mRNA của beta-globin có gene biến đổi.

Bây giờ ta làm sửa đổi sau đây cho khung số 1 (như đã làm cho khung 3 ở phía trên):

Xác định vị trí cho M (methionine) bắt đầu bằng cách chọn M theo sau là chuỗi aminoacids không bị gián đoạn bởi những điểm ngừng (stop codons *). Xóa bỏ những đoạn aminoacids đứng trước M bắt đầu đó (nếu có). Chọn điểm cuối của chuỗi protein bằng cách tìm đến điểm dừng (*) đầu tiên của chuỗi sau M bắt đầu này. Xóa bỏ đoạn aminoacids sau điểm dừng (*) này.

Sau đây là kết quả của công việc làm trên. Phần in chữ xanh phải xóa bỏ.

>183944 Translated - Frame 1
(không có phần aminoacid trước M bắt đầu)

MVHLTPVEKSAVTAXWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDA
VMGNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLL GNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH

*ARFLAVQFLLKVPLFPKSNY*TGGYYEGP*ASGFCLIKNIYFHC

Sau khi các bạn đã sửa đổi các chuỗi proteins có trong khung 1 và 3 rồi thì các bạn bấm chuột vào nút “Save” đặt ở cuối trang. Bây giờ chúng ta hãy quay lại trang chủ “Protein Tools” và các bạn sẽ nhìn thấy hai chuỗi protein mà bạn dã sửa đổi từ khung 1 và 3 và nhập từ sự diễn dịch “SIXFRAME”.

6) Bây giờ chúng ta muốn so sánh hai chuỗi protein này để xem chúng khác nhau ở những aminoacid(s) và ở vị trí nào. Dùng chuột để đánh đấu vào hai ô: GBPRI:183944,SIXFRAME Translated, edited – Frame 1, và ô: GBPRI:29436,SIXFRAME Translated, edited – Frame 3. Sau đó các bạn chọn “CLUSTALW” va bấm chuột vào nút “Run”.

Dụng cụ Clustalw dùng để sắp xếp hai chuỗi trên dưới song song để tiện so sánh chúng với nhau. Như kết qu3a cho thấy khi so sánh hai chuỗi beta-globin bình thường và biến đổi, chúng ta thấy chúng giống nhau ngoại trừ ở hai điểm.
Điểm khác biệt đầu tiên ở vị trí aminoacid số 7 của mỗi chuỗi: Trong chuỗi protein beta-globin bình thường thì aminoacid la glutamic acid, trong khi aminoacid ở chuỗi biến đổi lại là valine. Đây chính là sự biến đổi thực sự đã gây ra bệnh thiếu máu luỡi liềm (Sickle Cell Anemia) mà rất nhiều người Mỹ da đen mắc phải. Điểm khác biệt thứ hai là ở aminoacid số 15 của mỗi chuỗi. Tuy nhiên, sự khác nhau này là do aminoacid (X) ở vị trí này đã không xác định được một cách rõ ràng, vì vậy sự khác biệt này là không thực sự.

Kết luận

Với sự sử dụng các dụng cụ khác nhau trong phần mềm Workbench, chúng ta đã học thấy rằng sự đột biến thay đổi xảy ra trong bệnh thiếu máu lưỡi liềm chính là do sự biến đổi xảy ra ở mỗi một nucleotide (base) ở trong gene (chuỗi DNA) của một trong hai chuỗi beta-g;obin của hemoglobin của hồng huyết cầu của bệnh nhân. Sự thay đổi bắt đầu là do di truyền (genetics) của chuỗi DNA. Sự thay đỗi này được diễn dịch (transcription) sang mRNA, sau đò được diễn giải (translation) sang protein (beta-globin), với kết qủa là aminoacid glutamic acid o trong chuỗi beta-globin bình thường đã bị thay bằng aminoacid valine trong chuỗi beta-globin của bệnh nhân. Vậy tại sao có sự biến đổi của mỗi một aminoacid trong một chuỗi hàng trăm aminoacids trong hemoglobin lại có thể gây ra một bệnh hãi hùng, đau đớn như vậy? Muốn hiểu rõ điều này thì chúng ta học sang phần tới của phần mềm Workbench, đó là phần mềm 3-D dụng cụ mô hình mẫu (3-D modeling tools), nó giúp chúng ta nhìn mô hình cấu tạo của nó trong không gian 3 chiều, và do đó có thể so sánh sự khác nhau giữa hình thể trong không gian 3 chiều của hai loại protein này.

Phần VI.

Sử dụng phần mềm Protein Explorer để xem xét mẫu hình Hemoglobin Proteins bình thường (Wild Type) và biến đổi (Mutant) trong không gian 3 chiều (3-Dimention).

Trong phần đầu của bài tập này các bạn sẽ học cách để xác định nucleotide (DNA base) và sau đó là aminoacid đã bị thay đổi để gây ra bệnh thiếu máu. Các bạn sẽ học cách sử dụng phần mềm “Protein Explorer” để quan sát hình thể của hemoglobin proteins ở trạng thái bình thường và trạng thái biến đổi (mutant). Phần mềm này sẽ chỉ rõ sự khác nhau giữa hai phân tử hemoglobins này trong không gian 3 chiều, trong đó bãn sẽ thấy rõ sự thay đổi aminoacid từ glutamic sang valine đã làm cho hemoglobin co xụp lại và do đó hình dạng của hồng huyết cầu trở thành hình lưỡi liềm.
Hai chuỗi proteins mà chúng ta khảo sát có tên sau đây:
1hab = hemoglobin bình thường (normal, wildtype) trong đó không có sự thay đổi và không có bệnh.
2hbs = hemoglobin thay đổi (mutated) đã gây ra bệnh Sickle Cell Anemia.

Trước hết, chúng ta sẽ chú ý đến những hình thể của hai loại hemoglobins này. Sau khi chúng ta đã nhớ đến hình thể của loại hemoglobin bình thường và nhìn kỹ đến aminoacid sẽ bị thay đổi, rồi sau đó nhìn sang hình thể của phân tử hemoglobin bị biến đổi, lúc đó bạn sẽ nhận ra sự khác biệt giữa hai phân tử này.

CHÚ Ý: Rất quan trọng là các bạn phải tuân theo những lời chỉ dẫn từng bước một và làm đúng như vậy. Phần mềm Protein Explorer có thể bị bế tắc nếu bạn di chuyển chuột và thay đổi trang quá nhanh. Trong bài tập sẽ có nhiều báo động để tránh việc làm này. Nếu để ý đến các điểm này thì mọi chuyện sẽ chạy suông sẽ.

Phần A:

1. Chọn vào mạng Biology Workbench với địa chỉ:
http://www.workbench.sdsc.edu
2. Bấm chuột và kéo xuống cho đến khi nhìn thấy hàng chữ “Protein Explorer”.


Các bạn sẽ được dẫn đến trang mà các bạn cần phải đánh tên của protein mà bạn muốn khảo sát. Trong bài tập này bạn các bạn sẽ đánh chữ “1hab” vào ô chũ. Điền này sẽ mang cấu trúc cũa hemoglobins, cả dạng bình thường lẫn dạng dị biến để được quan sát. Sau đó các bạn bấm vào nút “Go”.

3. Hãy kiên nhẫn! Công việc tải chuyển dữ liệu này sẽ cần thời gian vài giây hay phút. Một khi trang mới được hiện ra, bấm chuột vào nút “Start Explorer Session”. Chương mục mới với tựa đề “1ha” sau đây sẽ được hiện ra:
 

Báo động!!!

Đừng làm gì hết nếu bạn thấy dấu hiệu “Busy” mầu đỏ này xuất hiện, các bạn phải đợi cho đến khi dấu hiệu đỏ (Busy)
biến thành xanh .
Khung hình sau đây sẽ xuất hiện. Tuy nhiên chúng ta không nhấn vào nút cho đến khi dấu hiệu Ready trong khung xanh xuất hiện.

Sau khi bạn đã nhấn vào nút “OK” sau khi đã nhìn thấy nút Ready xanh xuất hiện, chúng ta phải làm một vài điều để cho chương trình không bị bế tắc.

4. Bấm chuột vào nút “Toggle Spinning”. Điều này sẽ làm cho phân tử dừng lại mà không quay nữa và như vậy sẽ tránh được máy vi tính bị “đóng đông” lại.

Một khi phân tử đã dừng quay, chúng ta sẽ dấu kín những phân tử nước lại vì chúng che khuất
những gì chúng ta muốn xem. Muốn làm như vậy chúng ta bấm vào nút “Hide/Show Water”. Nếu các bạn tuân theo đúng như những lời chỉ dẫn thì các bạn sẽ được một hình phân tử hemoglobin trông như sau:
Nếu hình trên không có được thì hãy quay lại đọc kỹ lời chỉ dẫn và bắt đầu lại từ đầu.

5) Trước khi tiếp tục, chúng ta sẽ xem xét kỹ lưỡng phân tử hemoglobin này. Hãy đặt mũi tên của chuột (cursor) vào phân tử và ấn nút tay trái của chuột. Cho chuột chạy chung quay phân tử, điều này sẽ làm cho phân tử quay rồi quan sát phân tử dưới mọi khía cạnh mà bạn muốn. Chúng ta sẽ dùng kỹ thuật này sau này lần nữa để quan sát phân tử hemoglobin khi bị biến đổi (mutated) để sinh ra bệnh thiếu máu.
6) Bây giờ chúng ta đi tìm phân tử biến đổi hemoglobin. Trong hộp ở trên đầu trang và phía bên trái, chúng ta bấm vào nút “Explore More”.

Màn hình bên trái sẽ thay đổi. Bây giờ chúng ta sẽ làm một vài thay đổi để dễ quan sát hơn.

7) Đầu tiên, chúng ta hãy thay đổi cách nhìn của protein. Bấm chuột vào bảng có chữ “Display” (hình 1) và chọn bấm nét đậm vào hàng chữ “Cartoon”.
Chúng ta chọn “Cartoon” trong display menu bởi vì nó sẽ trình bầy cấu trúc bậc hai (secondary structures như là vòng xoắn (helices) alpha hay khăn xếp (sheets) beta. Cấu trúc bậc hai có được là do cấu trúc bậc nhất (primary structures) của chuỗi protein thẳng cong gấp lại trong không gian 3 chiều.

8) Bây giờ chúng ta chọn lựa mầu sắc cho các phân tử. Bấm chuột trên bảng “Color” và chọn mầu “Blue”. Cả phân tử sẽ đổi thành mầu xanh sau khi bấm chuột.

9) Bây giờ chúng ta đến gần đích hơn. Chúng ta biết là biến đổi trong phân tử hemoglobin gây ra bệnh thiếu máu lưỡi liềm là do sự biến đổi xảy ra ở chuỗi B của phân tử. Chính vì vậy, chúng ta nên thay đổi mầu của chuỗi B vì như vậy nó sẽ nổi bật khác với phần còn lại của phần tử và do đó chúng ta có thể nhận diện sự biến đổi của phân tử một cách rõ ràng hơn. Bấm chuột vào bảng “Select” và chọn “Chain B”.
Mọi sự sẽ không thay đổi ngay sau khi chúng ta bấm chuột để chọn lựa. Di chuyển chuột đến bảng “Color” và chọn lựa “Green” (mầu xanh lá cây). Sau khi bạn đã bấm nút “green” rồi thì chuỗi B của phân tử hemoglobin sẽ đổi thành mầu xanh lá cây. Xoay phân tử bằng mũi tên của chuột để quan sát phân tử.

10) Nếu các bạn làm đúng theo như những chỉ dẫn trên thì bạn sẽ có một phân tử trông như dưới đây.



Mầu xanh lá cây của Chain B là nơi của sự biến đổi xảy ra. Tuy nhiên, chúng ta hãy nhìn sự kiện một cách gần hơn nữa. Bởi vì aminoacid bị thay đổi trong bệnh thiếu máu lưỡi liềm đã xảy ra ở chuỗi B này, chúng ta có thể nhìn kỹ sự thay đổi đó ở chuỗi này. Bây giờ hãy làm chuyện đó….
 

11) Bấm chuột vào hàng nút “Advanced Explorer” (có thể bạn phải kéo chuột xuống để nhìn thấy hàng chữ này).
PHẢI NHỚ KỸ LÀ - ĐỪNG BẤM VÀO NÚT NÀO- KHI CHỮ MẦU ĐỎ “BUSY” XUẤT HIỆN Ở PHÍA DƯỚI HÌNH CHUỖI PHÂN TỬ. PHẦN MỀM CÓ THỂ BỊ ‘BẾ TẮC’ NẾU BẠN VÔ TÌNH BẤM VÀO.

12) Sau khi dấu hiệu “Busy” đã đổi sang “ready” thì chúng ta bấm chuột vào nút “Sep3D” (nơi có bàn tay trong hình). Điều này sẽ cho phép chúng ta quan sát từng aminoacid một trong chuỗi phân tử hemoglobin. Chúng ta sẽ dùng phần mềm này để khám phá ra sự thay đổi aminoacid nào mà gây ra bệnh thiếu máu lưỡi liềm.

13) Một trang mới với ba khung hình khác nhau sẽ hiện ra. Trong khung đầu tiên và ở phía bên trái chúng ta chọn ”Spacefill” (trong khung bắt đầu bằng “Ball & Stick”)

Bạn hãy bấm chuột vào hàng “Spacefill” để chọn tiêu chuẩn này rồi dời chuột đến ô “CPK Colors” và chọn “Sec’y (secondary) Structure”. Không có gì xảy ra cho phân tử này ngay!

14) Bây giờ các bạn nhìn xuống khung cuối ở góc bên trái Có rất nhiều hàng chữ, mỗi chữ tượng trưng cho một aminoacid trong chuỗi hemoglobin. Chúng ta muốn xem xét đến aminoacid (valine) đã gây ra sự thay đổi cấu trúc của chuỗi protein này và sinh ra trao đổi giữa Oxygen và Carbonic bị gián đoạn.
Vói mũi tên chuột, nhấn vào chữ “E” đầu tiên của chuỗi B (dấu mũi tên trở thành bàn tay như thấy trong hình trên) . Đây là aminoacid có tên là “glutamic acid” trong hemoglobin bình thường nhưng được thay bằng “valine” trong hemoglobin của bệnh thiếu máu lưỡi liềm. Aminoacid này nằm ở vị trí số 6 trong B chain của hemoglobin.
Khi bạn bấm chuột vào chữ E, nơi sự thay đổi đã xảy ra thì bạn sẽ nhìn thấy sự thay đổi này trên phân tử. Nó xuất hiện như vệt đỏ trên màn hình. Đó là nơi biến đổi xảy ra và gây ra bệnh thiếu máu lưỡi niềm. Các bạn hãy dùng chuột để quay phân tử để quan sát sự thay đổi nhỏ trên toàn diện cơ cấu của phân tử hemoglobin.

Phần B:

Bây giờ chúng ta đã nhìn thấy cơ cấu phân tử hemoglobin như thế nào và chúng ta cũng xác định được vị trí của aminoacid mà từ đó sự thay đổi sẽ xảy ra. Trong phần tới chúng ta sẽ mhìn thấy thực sự cái gì sẽ xảy ra trong phân tử đổi biến (mutated) hemoglobin.

1) Đóng khung cửa sổ mà nó có tên của tất cả aminoacids bằng cách bấm chuột trên hình trên cap bên góc trái của trang . (Nếu bạn không nhìn thấy khung này có thể là bạn đang ở trang “protein viewer”, như vậy bạn phải đóng trang này lại trước đã).
Một khi khung cửa này đóng lại rồi thì chúng ta mở (upload) một phân tử mới đó là “2hbs” (phân tử hemoglobin bị biến đổi trong bệnh thiếu máu lưỡi liềm).

2) Bấm chuột vào hàng có chữ “Different Molecule”.

3) Đánh hàng chữ “2hbs” vào ô ID như hình sau, sau đó bấm chuột vào nút “Load”

Một khung hộp mới sẽ hiện ra ở ngay giữa màn hình. Hãy bấm vào chữ “OK”. Một khung hộp mới xuất hiện. Bấm “OK” một lần nữa. Sau đó thì hình phân tử sẽ hiện ra. Nhớ lại rằng, đừng làm một cái gì hết khi có dấu hiệu mầu đỏ “Busy” ở cuối trang, góc bên phải của màn hình. Chúng ta phải đợi đến khi mầu xanh “Ready” xuất hiện.
4) Như làm ở phần trên, chúng ta dừng phân tử đang quay lại và dấu kín phân tử nước lại bằng cách bấm chuột trên các nút “Toggle Spinning” và “Hide/Show Water”.

 
5) Bây giờ các bạn sẽ sửa đổi phân tử lại một ít như ta đã làm ở phía trên cho phân tử hemoglobin bình thường. Hãy bấm vào nút “Explore More” ở phần cuối trang.

6) Di chuyển chuột đến phần “COLOR” và chọn mầu “Blue”

7) Kéo chuột đến khung DISPLAY va chọn "Cartoon” để trình bầy. Phân tử sẽ xuất hiện dưới dạng mầu xanh và có dạng hoạt họa cartoon.

8) Kéo chuột đến khung SELECT và chọn “Chain B”. Không có gì thay đổi ngay…….

9) Đi trở lại về khung COLOR và chọn “Green”. Chuỗi B sẽ trở thành mầu xanh lá cây.
Bây giờ bạn sẽ có hình cấu tạo của phân tử hiện ra. Tất cả phân tử sẽ có mầu xanh da trời trong khi chuỗi B sẽ có mầu xanh lá cây. Bây giờ bạn có thể nhìn thấy nơi nào có sự thay đổi xảy ra….

10) Bấm chuột vào hàng chữ “Advanced Explorer” (nhớ rằng có thể bạn sẽ phải kéo chuột xuống hàng để nhìn thấy hàng chữ này).

11) Một khi trang mới được xuất hiện thì bấm chuột vào nút “Seq3D”. Điều này sẽ trình bầy những aminoacids trong chuỗi 2hbs ihemoglobin.
 

12) Trong trang tới này các bạn sẽ chọn “Spacefill” ở trong khung ô bên trái.

13) Chọn “Sec’y (secondary) Structure” ở trong khung phía bên phải.
Không có gì thay đổi ngay đâu……

14) Bây giờ hãy nhìn vào các phân tử aminoacids. Có một aminoacid duy nhất thay đổi so với lần trước ở trên: thay vào vị trí E (glutamic acid, aminoacid ở vị trí số 6) của chuỗi B. là “V” (valine). Bấm vào aminoacid Valine thứ nhì trong chuỗi B này như hình sau đây.

Sự thay đổi một aminoacid duy nhất (từ Glutamic acid sang Valine) đã làm cho hai phân tử hemoglobin co sát lại với nhau như bạn sẽ nhìn thấy trong hình vẽ sau đây. Khi bạn bấm chuột vào chữ “V” thì sự thay đổi trên aminoacid sẽ được thấy rõ như trên hình.

Hãy So Sánh Phân Tử Hemoglobin Biến Đổi (mutated, bên trái) và Bình Thường (bên phải)

Thế tại làm sao cái “điểm đỏ” nhỏ bé này lại có thể gây ra sự “co dúm” của phân tử hemoglobin lại với nhau như vậy? Vấn đề này có được lá do Valine la một aminoacid “vô-cực, non-polar” trong khi glutamic acid là một aminoacid “hữu-cực, polar”. Điều này có nghĩa là vì Valine không thích kết hợp, đến gần với nước. Làm sao một phân tử “vô-cực” như là valine lại có thể tồn tại trong môi trường trong tế bào mà ba phần tư là nước. Để “dấu mặt” những phân tử nước này thì aminoacid này phải “co dúm” lại (ít nhất là phần bề mặt của nó sẽ không bị phô trương ra với những phân tử nước). Trái lại, những aminoacids “vô-cực” như Valines lại tụ hợp lại nhau tạo lại hình thể như “co dúm” lại trong phân tử hemoglobin bị biến thể này. Khi oxygen có rất nhiều thì phân tử này vẫn còn có thể làm được nhiệm vụ, tuy nhiên khi nồng độ oxygen thấp như khi bắp thịt làm việc co thắt thì phân tử hemoglobin bị biến đổi này có khuynh hướng kết tủa làm cho hồng huyết cầu biến thể thành hình lưỡi liềm với hai mũi nhọn. Hồng huyết cầu với hình thể lưỡi liềm như vậy có khuynh hướng bị kẹt lại ở những nơi như những mạch máu nhỏ và gây ra những đau đớn khủng khiếp và làm bắp thịt bị thương tổn.